肽的生产方法和肽产品中苦味的消除措施

     肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物, 氨基酸是构成肽的基本基团，分子间通过肽键相连接，它是蛋白质降解过程中的中间产物。含氨基酸残基50 个以上的通常称为蛋白质, 低于50 个氨基酸残基的称为肽, 肽中氨基酸残基低于10 个的称为寡肽, 含2 或3 个氨基酸残基的为小肽、低聚肽，也称小分子活性肽，其分子量分子量在180～10000 之间。 小肽在动物营养上有着重要的作用。一方面，一些肽类可以满足动物动物特殊的营养需要能够促进动物生长, 提高饲料利用率，使动物获得良好的生产性能。另一方面，某些肽类作为饲料添加剂能抑制外源性病原菌,而对动物肠道中共生生态系统中的微生物和动物细胞无破坏作用，从而起到保护动物的健康增加畜牧业的综合效益。

    1 肽的种类及其生理、营养作用

    肽从其功能上可以简单的分为2种：功能性小肽和营养性小肽。营养性小肽，指只作为蛋白合成的原料并有利于氨基酸吸收但不具备其它一些生理活性的肽类。而生物活性肽是指对生物机体的生命活动有具有特殊生理活性的一大类肽。由生物体自身的组织或器官产生的对其本身有生理调节作用的肽类称为内源性生物活性肽；而非机体自身产生的，以肽的形式被吸收后具有生物活性的肽类物质称为外源性生物活性肽主要起着调节动物体消化系统、神经系统、内分泌、免疫机能的生物活性作用。近年来的研究表明小肽在动物的营养和生理上起着重要的作用：

    1.1小肽可以促进氨基酸和矿物质的吸收。肽的吸收方式不同于游离氨基酸的吸收，它具有速度快、不易饱和、避免了同氨基酸竞争等特点，因而有利于机体吸收，这在很多试验中已经得到证明。例如施用辉在研究不同比例小肽与游离氨基酸对鸡氨基酸吸收的影响时发现,当完全以小肽的形式供给动物时,赖氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影响。小肽有利于矿物质的吸收是由于小肽能与Ca 、Fe 、Cu、Zn 等金属以螯合物形式结合,通过小肠绒毛刷状缘,以小肽的形式促进这些金属元素的转运和吸收。

    1.2功能性小肽还具有很多的生理学活性，如抗菌活性、免疫活性、抗氧化作用、抗高血压作用和降胆固醇作用，这些生物活性的实现和肽的种类、来源都有很强的联系。

    2 小肽的生产方法

    由于小肽结构的被阐明，生物技术、化学合成和基因工程的发展，小肽的生产和工艺有了许多的改进和创新。现在的肽类制品主要有有以下几种生产方法：

    2.1蛋白质的降解

    蛋白质的降解是现在生产肽类的主要方法，但根据其具体操作工艺有可以细化为以下几个具体类型：

    2.1.1酶解法

    是以蛋白质为底物并选择适当的蛋白酶，将蛋白质进行酶解，即可得到大量的具有各种生理功能的生物活性肽。此法产生的小肽分子量约在3000D左右，具有较强的生物学活性，而酶解所要求的条件较难控制，因此要注意与小肽酶解生产效果密切相关的因素如温度、pH 值、酶浓度、底物浓度、时间等。但最为关键的是酶的选择，一般可选用胃蛋白酶, 胰酶等动物蛋白酶,也可使用波萝和木瓜等植物蛋白酶。通过选择适当的蛋白酶, 可以获得大量具有各种功能的肽。但动物蛋白和植物蛋白水解后的产物有所不同的是动物蛋白可释放较大比例的肽，而植物蛋白释放较多的为游离氨基酸，为此酶解底物以选择高品质的动物蛋白为宜。此种方法虽然在工业上应用较广但是产品中带有苦味，对产品的品质的提高带来了一定的影响。

    2.1.2微生物发酵法

    是把蛋白酶的发酵生产和蛋白的酶解生产结合在一起生产肽的一种办法，从本质上讲它也是一种酶解法。这种生产方法降低了小肽的生产成本, 应用前景很好。此方法的关键是筛选出合适的菌种, 要求菌种本身及其分泌物对人畜安全无害, 并能够在蛋白质底物上良好表达, 菌种能分泌合适的蛋白酶在体外将蛋白质切成长短合适的肽段。现在生产上主要使用米曲霉、乳酸菌、芽孢杆菌等类能分泌蛋白酶的菌种，让菌种分泌的蛋白酶酶解蛋白质产生小肽蛋白，其肽产物的分子量分布大多在3000以上，其产品中的小肽以营养性小肽为主。但为了提高小肽的产量和品质还应注意底物的组成、菌龄、接种量、发酵时间等因素的影响。微生物发酵法的优点是能较好地去除蛋白原料中的抗营养因子和一些蛋白抗原成分，并且由于在微生物发酵过程中加入乳酸菌、酵母菌、米曲霉、芽孢杆菌等菌株，还可产生3%左右乳酸和发酵香味，具有酸化剂的作用，有利于提高动物采食量，改善动物胃肠道的微环境的作用。

    2.1.3酸解法和碱解法

    指在只有酸或碱存在的条件下使蛋白发生分解产生小肽的一种方法。由于碱水解时, 丝氨酸、苏氨酸等大部分氨基酸被破坏,且还会发生消旋作用, 产生D 型和L 型氨基酸的混合物, 营养成分损失大，因此, 很少采用此法来制取肽类；但用酸水解蛋白质则不会引起氨基酸的消旋作用，且水解速度快、反应完全彻底。用酸水解法制备小肽存在的问题是温度和时间对酸水解程度的影响, 其中温度的影响更大。并且所得水解产物中含大量因中和反应而产生的盐, 若能除去其中的盐并分离游离氨基酸, 则小肽含量可大大提高。总的来说酸解法和碱解法多用于试验机构，而在生产实践中使用较少。

    2.2化学合成法

    化学合成法分为液相法和固相法。液相法不适合反应中间体溶解度较低的情况。固相法是把要合成的多肽其中一端的氨基酸羧基、氨基或侧链基附着在固体载体上, 然后从氨基端或羧基端逐步增长肽链的方法。与液相法相比, 固相法易于纯化, 并可以实现自动化。但是由于成本高所以极大地限制了固相法的应用。主要原因在于在肽键形成中, 存在消旋作用因而需要保护和去保护操作, 导致产率低。另一方面由于 需要用超过量的耦联剂和酰化试剂, 并且回收这些组分相当困难, 所以也影响到了小肽的生产。

    2.3酶合成法

    酶合成法指用蛋白酶来催化合成肽。在活性肽的酶合成法中, 最广泛应用的酶是丝氨酸和半胱氨酸内切酶。酶法合成与其它合成方法相比具有: 在温和条件下进行, 危险性相对较低;专一性强，取材广泛；立体异构和消旋作用。但其在实际生产中的应用仍然有限，这主要是因为酶法合成肽的应用研究较少，没有体现酶法合成的优越性。

    2.4生物工程法

    生物工程法指从动物或植物的基因组中分离出带有目的基因的DNA 片段, 然后将此DNA 片段克隆至适当的载体并采用特定方法将其导入受体细胞, 通过细胞表达获得所需要的活性肽或将外源基因插入到噬菌体基因序列之中, 使得多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒表面，并经过加工、纯化后来获得所需要的小肽。虽然使用生物工程法只要建立起了一个适当的体系, 就可以用廉价的原料通过发酵的方法来获得大量活性肽，并且基因重组技术与其它方法相比有其不可比拟的优势, 但DNA 重组技术仅限于大肽的生产 ，而且其表达效率较低、产品提取和回收困难。此外, 用DNA 重组技术构建的细胞表达系统不能用于酰胺肽的生产, 因为微生物缺乏α- 酰化酶, 这限制了在生物活性表达方面起决定性作用的酰胺化的广泛使用。而噬菌体展示肽库技其缺点是库容多样性易受到多种因素的影响, 且获得的是小分子肽亲和力较低。

    3 肽产品中苦味的消除措施

    3.1肽产品苦味产生的原因

    多肽的苦味是由其中的疏水性氨基酸引起,与蛋白质的氨基酸结构组成有关,多肽疏水度、氨基酸序列及空间结构是重要的影响因素。一般天然蛋白质的疏水性基团都包含在分子结构内部,从而不会呈现苦味。当蛋白质水解成小分子多肽时,就会曝露出其疏水性氨基酸残基,此类氨基酸残基刺激味蕾,即呈现苦味。疏水度较大的氨基酸残基有赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸残基在多肽中的比例越高,则该多肽的苦味可能越强。疏水性氨基酸残基位于C - 端会导致苦加味强之外,还发现碱性氨基酸残基也会加强多肽的苦味，另外苦肽的苦味还与特定的分子构象相关,即多肽链两端较近形成回转构象，时苦味更强。但当相对分子质量大于5000D的大豆多肽没有苦味,相对分子质量在500～1000D的大豆多肽苦味最强。随着分子质量的减小,苦味逐渐减弱。

    3.2肽产品的苦味控制方法

    肽产品的苦味控制方法主要包括以下几种:加工工艺的改良及分离、提取、吸附、掩盖、酶法及微生物脱苦等方法。

    3.1加工工艺的改良

    在实际生产中所用的蛋白酶，都是非专一性内切酶，其对蛋白原料的内切酶解作用是随机的。无论选用何种酶制剂和采用什么酶解条件蛋白酶对蛋白原料的酶解都会或多或少地产生游离氨基酸，并且随着水解度的提高，蛋白质内部的氨基酸疏水性末端大量游离出小肽末端疏水性氨基酸残基也不断暴露，导致水解产物产生苦味。因而采用相同的酶解蛋白原料，不同的工艺和操作参数，将产生不同的酶解结果，将对小肽产品的品质有很大的影响，特别是酶添加量，底物浓度， 酶解温度，酶解过程控制，酶解过程加碱(酸) 频率及加碱(酸) 总量等条件的控制。因而应根据所要得到的小肽的种类和特性来研究酶的特性，选择合适的酶，优化生产工艺的各项参数从而避免了酶解方法的盲目性，使产品中所希望得到的小肽含量较高，苦味值也能控制在较低水平，产品质量也能够得到保证。

    3.2选择性分离法

    根据蛋白水解液中不同多肽成分的疏水性不同,利用活性炭、树脂或溶剂，将水解液中疏水性高的多肽予以选择性的去除。最早使用的除苦味方法是在小肽的酶解液中加入活性炭来进行选择性分离。活性炭是一种疏水性吸附剂，不仅可以除去水解液的不良风味物质和苦味成分，而且可除去大分子量的多肽、未水解的蛋白质片断和潜在的抗原性成分。但当活性炭用量达到较大时，活性炭可吸附小肽和多种对氨基酸，因而产品得率较低，不利于小肽的生产。另外，利用活性炭处理后的成品，其苦味虽然有所降低但也带来了活性炭的特殊气味。生产中还可以将酶解液经过预处理后加入到琼脂糖凝胶柱中，室温洗脱，含疏水性氨基酸的苦味肽便结合于凝胶载体上，从而达到脱苦的目的，不过这种方法脱苦不够彻底。

    3.3掩盖剂掩盖法

    向含苦味的蛋白水解液中加入一些能掩盖蛋白质水解液苦味的物质或其他疏水基团包被剂掩盖苦味来减轻苦味。一般情况下可以在蛋白水解液中直接甜味物质或酸味物质来改良肽产品中的苦味，这种方法成本较低，但感官评定显示，产品甜味和酸味过后仍能品尝到较浓的苦味。另一种方法是在蛋白质水解过程中加入交联淀粉，其主要机理在于交联淀粉能将苦味基团掩藏于淀粉的分子结构内部,从而阻止它们接触味蕾而起到掩盖苦味的目的。要达到这种效果，必须加热淀粉与苦味肽的混合物。苦味肽还可以和浓缩乳清蛋白、脱脂奶混合，也有脱苦或掩苦作用，其原因则是是蛋白质之间、氨基酸和肽之间存在亲和作用。

    3.4酶脱苦法

    酶脱苦法所使用的外切酶主要是指端肽酶，它是从肽链的一个末端开始将氨基酸水解下来发挥作用的，如果将其细分还可以再分为羧肽酶和氨肽酶，前者的作用从肽链的羧基末端开始一个个水解肽酶，而后者从氨基末端开始，端肽酶可以从肽链的末端移去一个或多个氨基酸分子，羧肽酶从C - 端，氨肽酶从N- 端起作用但外切酶所切下的氨基酸，其苦味阀值可能较低，甚至有可能是疏水性氨基酸，小肽蛋白中疏水性氨基酸可能再度暴露出来，增加苦味，因此这种方法的脱苦得不到有效保证，脱苦效果也不太明显。但是如果在脱苦工艺中添加风味酶，除了能产生外切酶酶解的效应，还产生美拉德反应，生成浓香味风味物质，产品苦味有较大缓和，对动物采食有利，但脱苦成本较高。

    3.5微生物发酵法

    一些微生物体内存在一定的产肽酶体系，它们能将苦味肽进一步水解，使苦味下降甚至完全脱除。例如用欧文氏菌细菌与胃蛋白酶水解的蛋白水解液作用，其脱苦效果十分显著。同样用乳酸菌和酿酒酵母水解鸡肉蛋白酶解液中的苦味肽，发现苦味肽的苦味强度下降十分明显，而且游离氨基酸的含量逐渐提高。同时由于此法中添加了有益微生物，故其发酵产物具有乳香味和酒香味等风味物质，并且产品的诱食性较好。　

    3.6类蛋白反应法

    这种方法最早是由日本科学家所发现，并且该反应可以极大的脱除蛋白水解物的苦味。浓缩的蛋白水解物在适当的条件下经蛋白酶作用就会形成凝胶状的物质，即发生“类蛋白反应”，该反应的进行主要依赖于底物的种类、酶、底物浓度以及pH值。对于该反应的机制，目前认同较多的是转肽作用的结果，通过转多肽作用，疏水性氨基酸在某些多肽中富集，而这些多肽由于溶解度较低会浓缩形成小颗粒，即形成不溶的类蛋白。

    4 小结

    肽对动物具很好的营养和免疫作用，可以极大的提高动物的生产性能，改善动物的健康状况，提高养殖业的经济效益，但是由于肽的肽的生产成本、生产工艺和产品质量如：功能性小肽的纯度和肽的苦味等因素的影响因而使小肽在动物生产领域不能广泛应用。因而研究肽的生产方法和影响肽品质的方法,对于肽的生产和产品品质的提高有重要的意义，并且也必然会成为今后所研究的焦点。同时生物工程和DNA技术的应用也必然为肽的生产带来更强的技术支持。

    河南农业大学牧医工程学院 徐兵 王成章

    河北宝恩生物科技有限公司 刘金猛