饲用微生物酶的生产和应用

【饲用微生物酶的生产和应用】 赵德英　茌亚青　盛福全　张景宏　陆书凯　任德胜(山东省济宁市化工研究所)

    1　微生物酶的分类、作用机理及来源

    1.1　淀粉酶。淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

　　α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

　　β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

　　糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。此酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。

　　异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

    1.2　蛋白酶。蛋白酶系催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称，它作用于蛋白质，将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸。此酶种类繁多，广泛存在于所有生物体内，按其来源可分为植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶(又可分为细菌蛋白酶、放线菌蛋白酶、霉菌蛋白酶等)；按其作用形式可分为肽链内切酶、肽链外切酶；按所产蛋白酶性能分为酸性蛋白酶、霉菌蛋白酶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。

　　酸性蛋白酶(最适pH=2～5)产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、似青霉、青霉、血红色螺孔菌等的某些种；中性蛋白酶(最适pH=7～8)产生菌主要是枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、微白色链霉菌、耐热性解蛋白质杆菌等；碱性蛋白酶(最适pH=9～11)主要产生菌为枯草杆菌、腊状芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、镰刀菌等。

　　微生物产生的蛋白酶大多是几种酶的混合物，只不过是主次之分而已。另外，改变培养基的组成或者菌种经诱变，可以改变产酶的性能，例如，据报道，黑曲霉的变株可生产碱性蛋白酶，米曲霉的变株可生产酸性蛋白酶。

    1.3　纤维素酶。纤维素酶是降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称。通常认为主要包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶。C1酶主要作用天然纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；CX酶又可分为CX1酶和CX2酶，CX1酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖，CX2酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子的非还原性末端作用于β-葡萄糖苷酶又称纤维二糖酶，它作用于纤维二糖，生成葡萄糖。这些酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖-葡萄糖。纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少。当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木菌、黑曲霉、青霉和根霉，此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单孢菌、侧孢菌、粘细菌、梭状芽孢杆菌等也能产生纤维素酶。

　　由于纤维素酶难以提纯，实际应用的纤维素酶(尤其在饲料工业中)一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶如果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等。

    1.4　半纤维素酶。半纤维素酶是分解半纤维素(包括各种降戊糖与聚己糖)的一类酶的总称，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。这些酶的主要作用就是降解畜禽消化道内的非淀粉多糖，降低肠道内容物的粘性，促进营养物质的消化吸收，减少畜禽下痢，从而促进畜禽生长和提高饲料利用率。半纤维素酶主要由各种曲霉、根霉、木霉发酵产生。在饲料工业中应用较多的是β-葡聚糖酶，它主要由曲霉、木霉和杆菌属类微生物产生，它应用于以大麦替工玉米的日粮中，借以降低饲养成本，而达到与玉米相同的饲喂效果。

    1.5　果胶酶。果胶酶是分解果胶的酶的通称，也是一个多酶复合物，它通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶三种酶。这三种酶的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，被转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基因，生成果胶酶；果胶酸酶切断果胶酸中的α-1，4-糖苷键，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸进入糖代谢途径被分解放出能量。工业生产果胶酶的菌种主要是霉菌，常用菌种有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等，此外，木质壳霉、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、葡萄孢霉、镰刀霉也能产生果胶酶。饲料工业中果胶酶多用于提高青贮饲料的品质。

    1.6　脂肪酶。脂肪酶作用于脂肪中的酯键，将脂肪分解成脂肪酸和甘油。生产脂肪酶的微生物主要有假丝酵母、园酵母、黑曲霉、根霉、白腐核菌、白地霉、青霉、毛霉、镰刀霉及假单孢菌、无色杆菌、葡萄球菌等。

    1.7　植酸酶。植酸酶是降解饲料中植酸及其盐的酶。饲料中玉米、大豆、豆饼及谷物中的磷，大部分存在于植酸和植酸盐中，这种形式的磷不能或很少被单胃动物利用，同时，植酸和植酸盐还是影响动物体内微量元素消化利用的螯合剂，严重影响二价阳离子矿物元素的利用，最终导致饲料成本增加、磷源浪费和环境污染。在饲料中添加植酸酶，可将植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸盐，供动物吸收利用，从而提高磷的利用率和骨骼矿化程度，减少饲料中磷源的添加和粪便中磷的排出，减少环境污染。产生植酸酶的微生物主要是酵母菌、霉菌和细菌。

    2　微生物酶的生产

    2.1　培养基。培养基不同，微生物的比生长速率和酶形成能力也不同，因而在培养基中提供适当而丰富的营养物，是菌体生长和酶大量产生的重要前提。酶制剂生产中所用原料主要包括碳源(包括能迅速利用的单糖、双糖和缓慢利用的淀粉、纤维素等多糖)、氮源(包括豆饼粉、花生饼粕、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆等有机氮源和铵盐、硝酸盐等无机氮源)、无机盐和诱导物，固体发酵往往还要加入一定量利用通风的载体如稻壳、玉米皮等。实践证明，培养基中碳源与氮源的比例即碳氮比(通常用C/N表示)就直接影响菌体的生长、繁殖和酶的生成。当C/N比值过小时，即培养基中氮源过多，造成微生物生长过盛，而碳源供应不足，容易引起菌体衰老和自溶，造成氮源浪费和酶产时下降；如果C/N比值过高，即氮源不足，微生物生长过慢，一方面容易引起杂菌感染，另一方面由于没有足够量的微生物来产酶，也会造成碳源粮费和酶产量下降。因此，应根据各种微生物的特性，恰当地选择适宜的C/N比值，是提高酶产量的重要措施。各种无机盐类和微量元素如磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、锌、锰等，是微生物细胞结构的重要成分或酶的组成成分或维持酶的活性，能促进微生物生长、发育、刺激酶的生成，培养基中不可或缺。对于含复杂成分的培养基来说，原料和水中往往已含有足够量的无机元素，一般不需另外添加。但不同菌种的需要量不同，应通过实验来研究确定。

　　饲料工业所用微生物酶大都属于诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。如加入槐糖能诱导木霉菌的纤维素酶的生成，木糖诱导半纤维素酶的生成。但诱导物价格往往比较昂贵，实际生产中一般加入廉价的含有诱导物的原料来代替，如槐豆荚等某些植物的种籽皮中含有槐糖，玉米芯富含木取糖，培养过程中可陆续被水解产生槐糖、木糖。

    2.2　产酶微生物的要求。生产酶制剂所用菌种要能利用比较廉价和简单和原料，且食性越广越好，在不需添加诱导剂的条件下容易生长，且生长迅速；产生的酶容易分离纯化和浓缩，酶活性要高，稳定性要好，活性谱要宽；产酶微生物应具有稳定的生理特性，而且不形成有毒或致免疫的代谢物。特别要说明的是，产酶菌种除公认是安全菌株外，都要做毒性实验。

    2.3　发酵生产。微生物酶的生产，目前主要采用液体深层发酵和固体发酵两种方式。与其他培养方式相比，液体深层发酵具有如下优点：1)液体悬浮状态是许多微生物的最适生长环境；2)在液态环境中，菌体、底物、产物(包括热)易于扩散，使发酵在均质或拟均质条件下进行，便于检测、控制，易扩大生产规模；3)液体输送方便，易于机械化操作；4)产品易于提取精制。与液体发酵相比，固体发酵具有如下缺点：1)生产工艺主要限于耐低水活性的菌中；2)微生物生长速度较慢，产物有限；3)大规模操作时，产生的代谢热较难散去，生产过程中固态发酵参数难以准确测定，难以实现操作的机械化及控制的自动化；4)生化反应器的设计还不完善，传统的发酵方式易染杂菌。但是，固体发酵也具有很多液体发酵所不具备的优点，主要表现为：1)培养基简单，多为便宜的天然基质；2)基质的低含水量可大大减少生化反应器的体积，不需要废水处理，较少环境污染，常不需要严格的无菌操作，后处理加工方便；3)不一定连续通风，一般可由间歇通风或气体扩散完成；4)产物的产率可较高；5)设备简单，投资小，能耗低。由于饲料工业附加值低，饲料用酶无需精制，因此，采用固态发酵更为合适。国内复合酶制剂的生产一般采用固态发酵，液态发酵主要用于植酸酶的生产或生产单酶制剂用于复配合酶制剂。

　　微生物酶的发酵生产是由微生物的生化活动和环境条件相互作用完成的。在发酵生产中，只有环境条件能够被直接调节和控制。除培养基成分及其浓度外，接种量、温度、pH、溶解氧等环境变量也都能影响微生物代谢活动，在固体发酵中，发酵空间的空气湿度及物料含水量也严重影响菌种的代谢活动和产酶量。菌种不同，生产酶制剂所需工艺条件也不同，其最佳工艺参数必须通过实验来确定。只有为培养物提供一个最适的环境，菌体的代谢活动才能得到最充分的表达，酶产量才高。

    2.4　酶的提取。在发酵基质中，酶都与大量的其他物质共同存在，而且酶的含量比其他物质要少得多，因此工业用酶需从大量的其他物质中将酶分离出来。但饲料用酶无需纯酶，且发酵所用基质及菌体在生长过程中所产生的氨基酸、维生素、核苷酸、促生长因子等成分对畜禽生长都是有利的，因此饲料用酶无需精制，只要将发酵基质进行浓缩(对液体发酵来讲)、干燥获得粗酶制品即可。

    2.5　酶的保藏。酶是生物活性物质，酸、碱、有机溶剂、重金属、表面活性剂、高温、紫外线等一些理化因素易引起酶结构发生变化，造成酶的失活，保藏时应注意避免这些不利因素。对于酶的保藏，要保持酶长期不失活，关键要控制好水分和温度两个条件。一般含水量高时酶易失活，含水量超过10 %，在室温或低温下均易失活；含水量降至5 %时，在室温或低温下较稳定，温度越高，越易失活。因此最好在低温下保存酶制品，特别是酶制品含水分较高时，更宜低温保存。日光照射有时也引起某些酶的失活，因此酶应避免日光直射。一些重金属离子(如铜、铁、铅、汞、银等)会抑制酶的活力，甚至会使酶失活，应尽量避免与这些物质接触。酶的底物和某些物质具有保存酶的作用，因此酶贮存时应根据酶的不同特性添加酶的稳定剂或进行包被处理，以使酶长期保存不失活。

    3　微生物酶的应用

    3.1　酶制剂在饲料工业中的应用日益广泛，从最初就用于仔猪、肉鸡逐步推广到生长猪、蛋禽、珍禽及草食动物、水产养殖中，从东南沿海逐渐延伸到西北内地。最初人们只是使用单一酶制剂，由于单一酶制剂成分单一，而饲料原料成分复杂，各地饲料原料、饲养方法、饲养环境各异，因而使用效果不太理想。现在，除了植酸酶还可作用单项酶制剂应用外，人们普遍使用含有多种酶类的复合酶制剂。由于各酶类之间相互协相互促进，因而复合酶制剂的使用效果较好。复合酶制剂，有的是采用多种单一酶制剂复配而成，有的是有用多株菌种协同发酵而成。由于多株菌种协同发酵的酶制剂除含酶制剂成分较多外，菌种生长过程中还产生一些氨基酸、维生素、促生长因子、核苷酸等成分。因此使用效果比复配的酶制剂要好。

    3.2　复合酶制剂的设计，应根据各种酶的特性、活性及饲料原料、饲养对象的不同而不同。有些酶制剂，体外测定活性挺高，作用效果也不错，但应用效果并不理想。主要原因是体外测定试验时其作用条件与畜禽消化道内的生理条件相差很大，致使高活性在畜禽体内表现不出来。如有些淀粉酶的最适作用温度为60℃，在畜禽体内(40 ℃在右)活性就达不到这么高；有些酶只有碱性条件下才发挥作用，畜禽体内的酸性环境就可使该酶失活。因此，选择酶制剂时，最好使酶的最适作用条件与畜禽消化道条件相一致，以使酶最大限度地发挥其作用。

    3.3　复合酶制剂所含酶的种类也并非越多越好，应根据饲料原料及饲喂对象而设计。如β-葡聚糖酶，国外主要用于添加于大麦日粮中以降解β-葡聚糖，而我国饲料主要以玉米-豆粕型日粮为主，添加β-葡聚糖酶就没有什么效果；果胶酶主要用于降解果胶，饲料中如无青贮饲料，添加该酶也没有明显效果。不同的饲喂对象、甚至同一饲喂对象的不同生长阶段，体内所需酶类也不一样，因此添加的外源酶制剂也不应相同，以免造成酶制剂的浪费或添加量不足，影响饲养效益。

    4　现阶段存在的问题

    4.1　微生物酶的生产属于微生物发酵的范畴，而应用属于畜牧业的范畴，由于专业间的差异，给酶制剂的管理造成一定困难。至今国内尚无饲料用酶制剂统一标准，各生产单位为了使用方便各自利益，自己制订活力单位、检测标准，给酶制剂质量评定、饲喂应用带来一定的困难，同时也不利于生产工艺的进一步优化和产品质量的提高。

    4.2　饲料用酶制剂发酵国内大多采用固体发酵，由于固体发酵生产工艺存在的一些缺陷目前无法克服，造成产品质量不如液体发酵稳定，在生产中(尤其是一些小厂家)有时带入杂菌，给应用带来一定的不利因素。

    4.3　饲料加工过程(主要是制粒)中的高温、配合饲料中的重金属离子、动物体内环境等可导致酶制剂失活，因此酶的稳定性是酶应用中的一大问题。应用中应注意对酶制剂进行稳定化处理。此外，筛选优良菌种或通过基因工程技术对菌种实行改造，使之产生的酶能耐高温、有较宽的pH作用范围等抗不良外界条件的性能，也是可供选择的一种好方法。