摘 要 ：为了探讨苏北地区人工养殖银鲫（Carassius auratus gibelio）“鳃出血病”的有效预防措施，取呈现“鳃出血病”典型症状的银鲫鳃组织与肝、脾、肾等内脏器官，制作成组织浆灭活疫苗，选择平均体重为（255.0±12.0）g和（73.0±6.0）g的银鲫，分别作为试验成鱼和幼鱼。经胸鳍基部对每尾成鱼注射0.3mL、幼鱼注射0.2mL的组织浆灭活疫苗后，将经过免疫接种的银鲫分别在室内水族箱中和室外小型池塘中继续饲养21d，待受免银鲫产生免疫应答。随后利用未经灭活处理的病鱼组织奖对免疫后的试验鱼注射攻毒，检测了接种组织浆灭活疫苗对不同规格银鲫的免疫保护效果。试验结果表明，在室内、外饲养的试验鱼经过未经灭活的组织浆攻毒后，与未经接种组织浆灭活疫苗的对照组银鲫相比，没有显示出任何免疫保护率。说明采用患“鳃出血病”的银鲫组织浆灭活疫苗接种健康银鲫的免疫接种方法，不能有效地预防银鲫“鳃出血病”的发生。推测其原因可能是由于银鲫“鳃出血病”的致病病毒属于具有囊膜的疱疹病毒，受免鱼产生的免疫应答是针对来自于鱼体自身组织的囊膜，而难以针对病毒粒子本身产生免疫应答的缘故。
关键词 银鲫；鳃出血病；组织浆灭活疫苗；免疫接种
2009年以来，在我国苏北地区的养殖银鲫（Carassius auratus gibelio）的所谓“鳃出血病”已经给养殖者造成了极为严重的损失。因为该病具有发病特急、病程很短、死亡率奇高的特点，这种疾病一旦发生，养殖业者根本就来不及采取任何治疗措施就已经出现批量死亡。已有研究结果证明，银鲫的这种“鳃出血病”的病原体可能是一种疱疹病毒[1]。
上世纪七十年代，人们利用患草鱼（Ctenopharyngodon idellus）出血病的病鱼组织浆制备出“草鱼出血病组织浆灭活疫苗”，注射接种草鱼鱼种后能有效地预防由呼肠孤病毒引起的草鱼出血病，该方法至今仍在我国南方的养殖业者用于草鱼出血病的预防[2]。
本研究借鉴“草鱼出血病组织浆灭活疫苗”的制备技术，利用来源于具有典型“鳃出血病”症状的银鲫的各种组织，制备了银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗，对健康银鲫进行了免疫接种防病试验，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 病鱼来源与组织浆疫苗制备
具有典型“鳃出血病”的银鲫来源于江苏省盐城地区的水产养殖场。在无菌条件下，取患病银鲫病鱼的鳃、肾、脾、肝和显症肌肉、肠等组织，称重后剪碎并经过匀浆机匀浆后，加入0.85％无菌生理盐水，以双层纱布过滤并在低温下以3000r/min离心0.5 h，取上清液以无菌生理盐水调节至10-1的组织浓度。
按组织浆上清液的量加入终浓度为100.0U/mL和100.0µg/mL的青、链霉素，再加入终浓度为0.2%的甲醛溶液，混匀后分装于玻璃瓶中，密封，置36℃恒温培养箱中灭活72 h。在灭活过程中，每天充分摇动2~3次。灭活过程结束后，取灭活疫苗样品进行对银鲫的进行安全试验，证明其安全性后，置4℃冰箱内保存，作为银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗备用。
1.2 疫苗的接种
将上述制备好的银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗，对平均体重为（255.0±12.0）g的银鲫成鱼和（73.0±6.0）g的银鲫幼鱼，沿胸鳍基部每尾成鱼注射0.6mL、幼鱼注射0.3mL后，分别放回设置于室内的水族箱和野外的小型池塘中继续饲养。以注射正常银鲫组织浆和生理盐水的银鲫，分别作为组织对照组和盐水对照组，而不注射任何物质的银鲫作为空白对照组。每个盛水1.0M3水族箱放养银鲫10尾试验鱼，在150M2水面的池塘中各放养80尾试验鱼。每天投喂2次裕达饲料有限公司生产的颗粒饲料。连续饲养21天。
1.3 攻毒
按照上述制备疫苗的方式，收集具有典型“鳃出血病”银鲫病鱼制备组织浆。对将经过免疫接种的试验组和对照组银鲫，沿胸鳍基部每尾成鱼注射0.6mL、幼鱼注射0.3mL后，放回水族箱中继续饲养。充气维持水体中有足够的氧气。每天投喂2次颗粒饲料并记录鱼体活动状态和死亡情况。最后按照如下公式计算试验鱼的相对免疫保护率（RPS）。
相对免疫保护率=[1－（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100%
2 结果
对室内水族箱中饲养的供试银鲫进行攻毒后的结果如表1所示。由表1可以看出，接种银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗后的银鲫，与接种正常银鲫组织浆和生理盐水的对照组银鲫相比，免疫试验组的银鲫死亡率与注射正常银鲫组织浆的对照鱼一致，均为96.7%；而且死亡率还高于注射生理盐水对照组银鲫的死亡率，后者的死亡率为86.7%；空白对照组银鲫经攻毒后的死亡率为93.3%。说明受免银鲫并未产生对“鳃出血病”的免疫保护力。
表1 接种后在水族箱中饲养的对照与试验组银鲫经人工攻毒后的相对免疫保护率比较
对野外池塘中饲养的供试银鲫进行攻毒后的结果如表2所示。由表2可以看出，接种银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗后的银鲫，与接种正常银鲫组织浆和生理盐水的银鲫相比，死亡率与3个对照组银鲫更高。说明对银鲫接种银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗后，受免银鲫并未产生对“鳃出血病”的免疫保护力。
表2 接种后在野外池塘中饲养的对照与试验组银鲫经人工攻毒后的相对免疫保护率比较
3讨论
对草鱼接种草鱼出血病组织浆灭活疫苗，已经被免疫接种的实践证明能有效地预防草鱼出血病的发生[3]。本研究参照预防草鱼出血病的技术制备的银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗，接种健康银鲫后的攻毒结果证明，受免鱼却没有获得对银鲫“鳃出血病”的免疫保护力，甚至受免鱼在经过毒力攻击后，试验鱼的死亡速度较接种正常银鲫组织和生理盐水的对照鱼更快、死亡率也较未实施免疫接种的对照鱼更高，这个结果说明利用灭活组织浆疫苗对银鲫接种的方法，是不能有效预防银鲫的这种疾病的。
推测其原因，可能是因为引起银鲫“鳃出血病”的病毒是属于具有囊膜的疱疹病毒，正是由于这种来自银鲫自身细胞的囊膜包在病毒粒子外面，所以，当我们对银鲫接种这种带有这种病毒的组织浆灭活疫苗后，试验银鲫在免疫应答过程中产生的免疫产物，在本质上是针对试验鱼自身组织的。即使针对自身组织的免疫应答，也是需要消耗试验鱼体内的能量的。所以，试验鱼的死亡率较对照组还高，就是由于试验银鲫在免疫应答过程中消耗了更多的能量，却并没有产生相应的特异性保护性物质——特异性抗体的缘故。由此看来，为了有效地预防银鲫的“鳃出血病”，还必须进行更为深入地研究或者是寻找其他的途径和方法。
当然，由于受到试验条件的限制，上述结论还只是非常初浅的。尤其是所谓的银鲫鳃出血病组织浆灭活疫苗，是完全按照草鱼出血病组织浆灭活疫苗的制备方法进行的。这样的制备方法和条件是否能保留组织浆中的病毒粒子，因为没有准确调整组织浆的pH值，病毒是否会吸附在其它蛋白质碎片上，而在过滤或者离心过程中被除掉？其次，每一种病毒的灭活条件是不一样的，试验中36℃、72小时对“鳃出血病”的病毒是合适的？因为没有该病毒的抗血清，证明这些问题是否存在尚有困难。
参考文献
1 全国鲫鱼重大疫情紧急报告 鲫鱼病毒性出血病. 中国水产网，2012-07-23.
2 中华人民共和国行业标准. 草鱼出血病组织浆灭活疫苗. SC 1001-92.中华人民共和国农业部1002-11-06批准，1993-04-01实施.
3 陈道印，欧阳敏. 草鱼出血病简易疫苗本地化制作与应用效果观察报告. 江西农业学报，2009，21（10）：143~144.
