产气荚膜梭菌曾被称为魏氏梭菌,首次由Welchii和Nutall从一具腐败的血管中产生气泡的人类尸体中分离得到,并以Welchii命名为魏氏梭菌。产气荚膜梭菌是一种不严格厌氧、可产生孢子的革兰氏阳性菌。该菌在血液琼脂培养基中在厌氧的条件下培养24h后,其菌落直径通常在3-5mm左右,呈灰色、圆形。大多数情况下,菌落周围有两个由其外毒素perfringolysin引起的内部完全溶血环,以及一个外部的不完全溶血环。有一部分产气荚膜梭菌不携带分泌外毒素perfringolysin的基因,因此这些菌株可能不会显示通常看到的特征性双溶血区。
产气荚膜梭菌在自然界中的分布极广,如土壤、饲料、食物、粪便以及人畜胃肠道等,在一定条件下可导致家禽严重的全身性和肠道疾病,包括气性坏疽、食物中毒和非食源性腹泻、小肠结肠炎和坏死性小肠结肠炎等严重症状,因此给全球家禽业造成严重的损失。
产气荚膜梭菌的致病性很大程度上归因于其感染肠道后分泌产生的外毒素。研究表明,其庞大的毒素库包含多种外毒素,其中主要的外毒素分别为α外毒素(CPA)、β外毒素(CPB)、ε外毒素(ETX)、ι外毒素(ITX);肠毒素(CPE)、坏死性肠炎B样毒素(NetB)。临床上可根据这六种主要的外毒素类型将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F、G七种毒素型(表1)。其中产气荚膜梭菌F和G菌株是基于肠毒素和坏死性肠炎B样毒素的发现而新产生的分型。此外,不同型的产气荚膜梭菌菌株可以产生近20种所谓的微量毒素,如δ溶血素、产气荚膜梭菌大细胞毒素(TpeL)及FPO等。
表1 产气荚膜梭菌七种毒型分泌外毒素情况
产气荚膜梭菌作为肠道中的主要菌群之一,对于肠道稳态的稳定是必不可少的。鸡群在一定条件下感染产气荚膜梭菌后导致其数量剧增,引起鸡群肠道内环境稳态失衡。与此同时产生大量外毒素,对肠道上皮细胞产生严重的损伤,从而导致鸡群发生坏死性肠炎。
产气荚膜梭菌缺乏许多参与氨基酸生物合成的相关基因,因此在鸡群体内只能通过降解组织来获得生长所必须的营养物质,而其降解组织的能力主要取决于其产生的多种外毒素。产气荚膜梭菌外毒素可根据其活性分为膜损伤酶、成孔毒素、细胞内毒素和水解酶。其中膜损伤酶α外毒素主要通过水解宿主细胞膜成分来损伤靶细胞膜。成孔毒素是该菌外毒素中最大的一类包括θ外毒素、NetB、β2外毒素和肠毒素。该类毒素可通过宿主细胞膜导致膜形成小孔或大孔,导致宿主细胞死亡。细胞内毒素主要被内化到宿主细胞中以破坏细胞骨架,包括TpeL外毒素。最后,水解酶参与降解或水解与宿主细胞表面相关的底物,包括多糖降解酶(例如唾液酸酶和透明质酸酶)和蛋白酶(例如胶原酶)。
感染产气荚膜梭菌的鸡群通过分泌多种外毒素作用于肠上皮组织,使其遭到破坏,释放更多供该菌利用的营养物质,促进菌体增殖,如此循环往复,最终使肠道上皮组织发生坏死性肠炎。肠道发生坏死性损伤后,造成上皮细胞消化吸收功能降低,导致饲料利用率不足,从而降低其生产性能。长此以往,鸡群会发生消瘦、脱水、腹泻、生长缓慢等临床症状,严重的话会导致鸡群死亡[7]。
(1) 饲料因素
饲料因素是常见的引起鸡坏死性肠炎的一个非传染性因素,饲料中营养物质的配比可能会引起对鸡发生NE。多项研究表明,饲料中含有太多的非淀粉多糖(NSP),例如β-葡聚糖或阿拉伯木聚糖,会增加食糜的粘度并使鸡易患NE。饲喂含有小麦或大麦的日粮时,食糜粘度较高会导致在肠道中的转运时间延长,这可能是肠道粘度与梭菌计数直接相关的原因。
饲料的大量动物源性蛋白质使鸡群易患NE。甘氨酸是刺激α毒素生长和产生的氨基酸之一,并且与肠道中产气荚膜梭菌的数量呈正相关。胰蛋白酶抑制也是产气荚膜梭菌引起的肠道疾病的诱发因素,因为小肠中的胰蛋白酶会破坏产气荚膜梭菌毒素。此外,饲料颗粒的大小已被证明会影响肠道中产气荚膜梭菌的数量。与粗饲料相比,高研磨饲料可使产气荚膜梭菌增殖更快且数量更多。
(2) 球虫因素
球虫病是一种由各种艾美尔球虫引起,寄生在家禽肠道并杀死上皮细胞的一种原虫病。当鸡群感染球虫后导致加禽肠道黏膜上皮损伤后,可能引发某些产气荚膜梭菌快速增殖并产生多种外毒素损伤肠道引起家禽坏死性肠炎。球虫感染诱导的黏液生成也可能很重要。因为在艾美球虫感染期间,蛋白质(包括血浆)泄漏到肠腔中,为产气荚膜梭菌增殖和毒素产生提供了富含蛋白质的营养物质。因此,临床上经常使用球虫与产气荚膜梭菌一起诱导动物产生NE。
(3) 菌株因素
产气荚膜梭菌在致病过程中可产生多种外毒素,早期研究表明α外毒素是导致鸡产生坏死性肠炎的主要因素[9]。但随着越来越多的研究表明NetB毒素才是致病的关键。NetB毒素基因又与近期发现的NELoc-1、NELoc-2和NELoc-3有密切的关系,其中NELoc-1和NELoc-3是由质粒编码的[10]。另外,TpeL毒素会对NetB阳性的A型CP有加强的效果,可以导致更加严重的NE发生。
肉鸡坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌A、C、G型菌株引起的,其产生的α外毒素是引起气性坏疽以及坏死性肠炎的主要原因,有时会伴随着艾美尔球虫的感染。在传统肉鸡饲养中,从两周龄(WOA) 到屠宰的任何时间均有可能感染产气荚膜梭菌,并会产生临床和亚临床症状。
坏死性肠炎的突出特征是急性死亡的临床症状,家禽死亡率可高达50%。其临床症状包括抑郁、脱水、嗜睡、羽毛褶皱、腹泻以及饲料转化率降低等。肉眼可见最明显的病变见于小肠,但也可见于其他器官,如盲肠、肝脏和肾脏。其中十二指肠、空肠和回肠,有时还有盲肠,表现为壁薄、易碎、扩张并充满气体。粘膜表面覆盖着灰色(棕色)至黄色(绿色)的白喉膜或假膜。此外,在濒临死亡的鸡群中往往伴随着多种脏器如肝脏、脾脏、心脏和肾脏的充血,并且红细胞形状不规则甚至会发生溶血。
当鸡群表现为亚临床症状时,往往导致生产性能下降。在这种情况下,仅发现肠道粘膜的局灶性坏死。研究表明,通过实验接种产气荚膜梭菌可产生亚临床症状,具体表现为十二指肠的轻微坏死,回肠则不太常见。除了常见的坏死性肠炎的临床表现外,亚临床感染也可能与肝炎或胆管肝炎有关。其表现为肝脏体积明显增大,呈淡色网状图案,有时带有星状病灶。组织病理学表现为胆管增生、纤维素样坏死、胆管炎等。有学者成功使用产气荚膜梭菌诱导鸡产生坏死性肠炎的症状,表现如图1:
(1) 接种疫苗图1鸡坏死性肠炎的不同病变。A:空肠段外翻。没有肉眼可见的病变。B:空肠段外翻。黏膜内无明显溃疡,但整个黏膜表面覆盖一层黏附松散的纤维蛋白。C:空肠段外翻。粘膜有一个凹陷性溃疡,溃疡床内有急性鲜红色出血,周围有少量的纤维蛋白结痂。D:空肠段外翻。粘膜有一个凹陷的溃疡,溃疡床内有深绿色黑色的色素,表面有少量的纤维蛋白结痂。e-f:空肠段外翻。黏膜有凹陷性溃疡,溃疡周边被厚厚的、紧密黏附的纤维蛋白层、坏死组织和炎性细胞覆盖。g-h:空肠段外翻。黏膜被纤维蛋白、坏死组织和炎症细胞形成的大而融合的斑块(g)覆盖,并延伸至肠黏膜的广泛区域(h)。
接种疫苗是预防疾病最有效的方法之一。疫苗有助于身体的免疫系统识别和根除威胁生命的病原体。梭菌疫苗含有一种或多种由产气荚膜梭菌、诺氏梭菌和败血梭菌产生的外毒素,已被证实对包括家禽在内的多种家畜动物具有保护作用。此外,大量研究表明接种全福尔马林灭活疫苗、细菌类毒素疫苗、类毒素疫苗、基因工程苗、多价苗等均已观察到接种疫苗和未接种疫苗的动物之间存在显着差异。
(2) 饲料添加剂
口服对宿主健康有益的益生菌如蜡样芽胞杆菌等,通过竞争营养物质、降低pH和产生特定的抗菌物质去抑制有害菌。其次可以添加益生元,它可通过有选择性的刺激结肠中无害细菌的生长和活性,对宿主产生积极影响,有利于改变结肠微生物菌群,从而提高总体肠道健康。此外,许多植物提取物和精油已被证明对产气荚膜梭菌具有体外生长抑制活性,例如百里香酚。
(3)其他防控方式
NetB毒素是一种穿孔素,其已被证实对鸡肠道上皮细胞具有毒性作用[18]。目前胆固醇已被证实在NetB成孔过程中行使很重要的作用。这一机制的发现对预防产气荚膜梭菌降低其毒性提供重要依据[19]。另外微量元素的添加也是一种重要的促生长和防病方式,例如硒元素可促进机体免疫力并增强机体抗氧化能力。研究表明,在18日龄鸡胚中注入硒,随后将雏鸡感染产气荚膜梭菌,结果表明注入硒的雏鸡具有更高的抗NetB和抗α毒素抗体。