我国蛋品工业发展迅速，但蛋壳利用率却很低[1]。目前，我国对蛋壳垃圾的处理主要是粉碎之后用作动物的补钙饲料，而大部分企业则直接将其置于环境中，造成蛋壳大量堆积，且这些蛋壳中残留的蛋清及蛋壳膜会很快腐败变质，不仅污染环境，也造成蛋壳资源的浪费[2-3]。因此，蛋壳资源的开发利用已成为我国蛋品加工业亟待解决的一项重要问题。已有科技工作者通过煅烧法和直接反应法等方法将蛋壳中的碳酸钙转化为有机酸钙，但普通钙质在人体内利用率很低，而生物活性钙剂采用特殊工艺处理，使之成为易被人体消化、吸收和利用的活性钙，产品呈白色粉末状，无味，可作为天然食品强化剂，适用于烘焙产品、酸性饮料中，也可应用于各种口味的方便调料中[4-5]。因此，选择鸡蛋壳为原料进行食品级钙螯合物的制备工艺研究，以期达到对鸡蛋壳资源化利用的目的。
1材料与方法
1.1试验材料
新鲜鸡蛋壳；胃蛋白酶（活力单位1.25万U/g），购于诺奥酶制剂生物有限公司；供试菌：植物乳杆菌（Llactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），由中国农业大学微生物实验室提供。
1.2供试试剂
柠檬酸钠溶液；NaOH溶液；HCl溶液；钙指示剂和钙标准溶液；EDTA标准溶液；硫酸、高氯酸、硝酸消化液；15%硫酸溶液。试剂均为分析纯，由北方天医化学试剂有限公司提供。
1.3试验方法
1.3.1蛋壳酶解钙溶液的制备。制备流程：新鲜蛋壳→粉碎→酶解→离心→冷冻干燥→灰化→测钙。其中粉碎、酶解、离心的具体步骤如下：①粉碎：鸡蛋壳在55 ℃烘干，用研钵粉碎，过800目筛3次；②酶解：选用胃蛋白酶，酶解时间分别为3、4、5 h，底物浓度分别为1∶2、1∶2.5、1∶3，添加量分别为1 800、2 000、2 200 U/g，酶解温度37 ℃，最适pH值3.0（酶解过程中不断加入1 mol/L氢氧化钠溶液和6 mol/L盐酸溶液调节pH值）；③离心：酶解结束后，90 ℃灭酶10 min；待温度降至室温后，90 g离心10 min，取上清液装入灭菌的玻璃容器。
1.3.2发酵剂的制备。①菌种活化：将植物乳杆菌、戊糖片球菌（活化温度均为37 ℃）、嗜热乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌（活化温度均为39 ℃），按1%接种量分别接入经121 ℃、15 min灭菌的液体MRS培养基中，活化3代后菌数达到107～108 cfu/mL即可。②菌种传代（3 d）：挑菌种于10 mL液体培养基，37 ℃培养24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液体培养基中，培养24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液体培养基中（第3代）。③菌数测定（1 d）：用倾注平板法测定活化3代后的菌种菌数。④菌种驯化：试验采用在液体MRS培养基中逐步增加酶解液含量，具体比例按表1进行，使乳酸菌逐渐适应以酶解液作为培养基的生长环境。
按表1比例混合后，将2个菌种分别接种于1号培养基，置37 ℃恒温摇床培养，每隔5 h观察1次培养状态。驯化过程中，每驯化1个梯度时，反复驯化2～3次。如果在9～10 h内，培养基出现明显浑浊，且菌落总数达到107～108 cfu/mL，则将其转接到下一比例的培养基中继续驯化。⑤高温灭菌：将蛋壳酶解溶液、（MRS）培养基、枪头、离心管、玻璃瓶、玻璃棒在121 ℃灭菌15 min。
1.3.3钙含量测定――EDTA法（GB12398-90）。①样品处理：取2 mL的样品干法灰化后，加入1∶4盐酸5 mL，置于水浴上蒸干，再加入1∶4盐酸溶解并移入25 mL容量瓶中，用热无离子水（70～80 ℃）多次洗涤灰化容器，洗涤水并入容量瓶，冷却后用无离子水定容。②测定方法：取5 mL经前处理后的样品，加水15 mL，加入0.05 mol/L柠檬酸钠2 mL、2 mol/L氢氧化钠2 mL、钙指示剂5滴，用EDTA溶液滴定至纯蓝色，记录EDTA消耗量。以蒸馏水代替样品做空白试验。再利用下式计算出钙含量。
总钙（mg/100 g）=■×100
式中：T―1 mL EDTA标准溶液相当于钙的毫克数；V―滴定样液消耗EDTA溶液体积（mL）；V0―滴定空白消耗EDTA溶液体积（mL）；V1―测定时取样体积（mL）；V2―蛋壳酶解样液定容的总体积（mL）；V3―称取蛋壳酶解样液体积（mL）。
1.4试验设计
1.4.1胃蛋白酶酶解蛋壳正交试验设计。根据试验因素水平选取3因素3水平编码表，选取L9（34）正交表作为试验方案（表2）。
1.4.2蛋壳酶解液菌种发酵试验设计。发酵条件：将酶解液用植物乳杆菌和戊糖片球菌（1∶1）在37 ℃下进一步发酵，接菌量8.7%，发酵时间19 h，葡萄糖添加量3.93%。发酵液浓度为0.2 kg/L。发酵步骤：每隔6 h取30 mL发酵液（混和均匀），测定其钙含量和pH值，如果24 h内钙含量有下降趋势，用6 mol/L HCl调解pH值降至3，温度升高到37 ℃，终止发酵。
2结果与分析
2.1正交试验的直观分析（极差分析）
根据极差R的大小进行因素的主次排队，可以看出各因素的重要性：酶解时间（A）＞底物浓度（B）＞酶用量（C）。且因素A、B、C的R值都大于空列的R值（表3）。因此，此次试验没有不重要因素的存在。
由图1可知，各因素最优的水平组合为：A2B3C2，与试验结果第5组最优矛盾，故还需进行验证试验。经验证试验测得A2B3C2钙含量为4 648 mg/100 g，小于试验所得值4 672 mg/100 g，故试验最优组合为第5组，即酶解时间为4h、加水量为12.5 mL（即底物浓度为1∶2.5）、酶用量为0.055 g（2 200 U/g）。因此，试验最佳酶解条件确定为pH值3，酶解温度37 ℃，酶解时间4 h，酶用量为0.055 g（2 200 U/g）、加水量为12.5 mL（底物浓度为1∶2.5）。
2.2酶解发酵后样液中钙的含量
采用EDTA滴定法测定样液中钙的含量，具体步骤如下：分别取样品0.968 7、0.973 2、0.699 8 g，配制成酶解样液，均取5 mL于250 mL容量瓶中，而后定容待测。用EDTA滴定样液，分别消耗EDTA溶液体积25.13、24.70、24.93 mL，空白样消耗EDTA 0.28 mL。通过计算各组样液中钙含量分别为4 912、4 894、4 957 mg/100 g，平均为4 921 mg/100 g。可见，采用最优水平组合酶解，在此基础上经过发酵处理，每100 g蛋壳中获得4 921 mg钙。
3结论与讨论
试验利用酶解和发酵联用技术，研究了提高蛋壳中钙的生物利用率的最佳工艺条件，以提高蛋壳中钙的转化率。由试验可知，植物乳杆菌和戊糖片球菌1∶1混合后发酵胃蛋白酶酶解后的蛋壳酶解原液，发酵液中钙含量高于原酶解液，100 g蛋壳经酶解发酵可得4 921 mg钙，经过酶解方法处理只能得到4 672 mg钙，相比只用酶解的方法，酶解发酵方法对蛋壳钙转化率有影响，但影响不显著，而在实际生产中使用酶解方法比酶解发酵的方法简便、经济，故实际生产生活中应采用酶解的方法处理蛋壳，进行批量生产[6]。
本文摘自中国论文网，原文地址：http://www.xzbu.com/8/view-1056674.htm
