克伦特罗ELISA快速检测的几点操作体会

　克伦特罗属于β-兴奋剂类药物，可以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长。目前由于多起克伦特罗中毒事件且出现了死亡案例，因此被禁止使用。克伦特罗ELISA快速检测试剂盒与经典色谱法相比，具有操作过程简单、样品处理快捷，可同时分析多个样品，分析时间短、成本低、灵敏度高且对环境污染小等优点。

    1 原理
    ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

    2 试样的准备
    2.1 对于尿样可直接用于检测，或者样品比较浑浊时，可适当离心。当尿样冷冻时，应将尿样回温再测。
    2.2 饲料样品要按照说明书的处理步骤进行。当然，为保证样品充分被提取，可适当延长涡旋时间、离心时间及离心转数。

    3 试剂的准备 
    3.1 不同批次的试剂盒不能混用，因为抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
    3.2 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。
    3.3 从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
    3.4 检测过程中应尽量保持室温20~25℃，避免在通风口操作，温度过低、过热或蒸发都会影响检测数据的准确性。同样不应再阳光直射下实验，防止过热或蒸发带来影响。

    4 加样 
    4.1 在ELISA中一般有4次加样步聚，即加标本或样品、酶结合物、底物、终止液。加样时应将所加物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，当有气泡时可用干净的枪头小心刺破。
    4.2 加标准及样品时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中，每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。
    4.3 在加酶标物、底物、终止液时，建议尽量使用多道移液枪，以缩短反应时间。尤其是酶标物和底物液用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。当然，多道移液枪适合整板样品的检测，加酶标物、底物、终止液时可整瓶加入。如果只需要对少量样品检测时，加酶标物、底物、终止液动作一定要迅速、准确，避免枪头碰壁或液体溅出。

    5 保温孵育
    5.1 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加酶结合物和加底物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育，保温过程按照说明书要求，一般为常温（20~25℃）温育，可根据室温适当调节保温时间。
    5.2 在孵育期间，如果工作台温度过低，应适当铺垫纸巾或其他材料。
    5.3 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后再添加样品，有利于检测结果的准确性。

    6 洗板
    6.1 ELISA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
    6.2 洗板时尤其是将孔内液体甩干时，动作要快、要干净利落，要把整板垂直倒置，将液体甩出，防止各孔液体混流，最后在吸水纸上拍干，不可甩干。此种方法可有效避免试剂盒孔的交叉污染。
    6.3 洗板次数和两次洗板间隔时间应尽量按照说明书进行。

    7 显色
    7.1 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
    7.2 在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。
    7.3 定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。

    8 测定
    8.1 对定量判定应绘制半对数曲线，从曲线上读出样品对应浓度值。本实验室酶标仪通过吸光度可直接得出浓度值，再乘以相应稀释倍数即为样品中克伦特罗的实际浓度值。
    8.2 对于每次实验浓度值的准确性判定可观察标准样品的吸光度值是否为线性关系，即吸光度值是否呈梯度递减。当吸光度值无明显梯度时应考虑重新检测。因为标准检测不准确，机器依照标准检出的数据也会不准确。
    8.3 当板间差异性大时，可能原因是板与板之间孵育时间相差太大，板与板之间洗涤不一致，移液枪使用不当，温度不同等。
    只要操作者严格按照步骤进行，并且每项操作都认真、仔细，尤其注重细节的操作，克伦特罗ELISA快速检测试剂盒的准确性也相对较高，较适合实验室大批样品的检测需要。

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