气相色谱质谱联用法检测饲料中三聚氰胺的探讨

 本文以气相色谱串联质谱联用法（GC-MS）测定饲料中违禁药物三聚氰胺的含量。试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，以气相色谱质谱联用仪进行定性和定量。

    1 试剂与材料
    1.1 衍生剂
    N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）；乙腈：色谱纯；甲醇：色谱纯；氨水：浓度25%～28%；混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg，3mL；
    10g/L三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸10g加水溶解定容至1 000mL；
    5%氨水甲醇溶液：量取氨水5mL，用甲醇定容至100mL容量瓶中；
    22g/L乙酸溶液：称取乙酸铅22g用约300mL蒸馏水溶解后定容至1 000mL容量瓶中；
20%甲醇溶液：量取甲醇200mL加入超纯水800mL，混匀；滤膜：0.45μm，有机相；三聚氰胺标准品（国家标准物质中心提供）：纯度≥99%。
    1.2 三聚氰胺标准溶液
    三聚氰胺标准储备液：精确称取三聚氰胺标准品100mg，用20%甲醇溶液溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，该溶液浓度为1.0mg/mL，于4℃冰箱内贮存，有效期3个月；
    三聚氰胺标准中间液：吸取三聚氰胺标准储备液5.0mL，用20%甲醇溶液定容至50mL棕色容量瓶中，该溶液浓度为100μg/mL，于4℃冰箱内贮存，有效期为1个月；
    三聚氰胺标准工作液：用移液管准确移取三聚氰胺标准中间液10mL，用20%甲醇溶液定容至100mL容量瓶中，该溶液浓度为10μg/mL，有效期为1周。
    1.3 仪器与设备
    气相色谱质谱联用仪（气质联用仪）；离心机：10 000r/min；涡旋混合器：0～2 500r/min；超声波清洗器；氮吹仪：可控温至50℃；固相萃取装置（带真空泵）。

    2 测定步骤
    2.1 提取
    准确称取饲料样品5g（精确至0.0001g）至100mL具塞离心管中，准确加入10g/L三氯乙酸溶液50mL，加入22g/L乙酸铅溶液2mL，摇匀，超声提取30min，静止2min，取上层提取液约30mL转入50mL离心管中，置于离心机上10 000r/min离心10min，取至少15mL的样品上清液过0.45μm滤膜。
    2.2 净化
    分别用甲醇3mL，超纯水3mL活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取样品提取液10mL分次过柱，控制过柱速度在1.0mL/min以内；再次用超纯水3mL，甲醇3mL洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽至近干后用5%氨水甲醇溶液3mL洗脱；收集洗脱液于5mL具塞玻璃管中，置于氮吹仪上50℃氮气吹干。
    2.3 衍生化
    将已吹干的玻璃管内加入乙腈200μL，衍生剂200μL，置于涡旋混合器上充分混匀，放入70℃的培养箱内衍生反应30min；同时准确移取三聚氰胺标准工作液1.0mL于5mL具塞玻璃管中，氮气吹干后做同步衍生。

图1 三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱与质谱图

图2 三聚氰胺空白样品衍生物选择离子色谱与质谱图

图3 三聚氰胺添加样品衍生物选择离子色谱与质谱图

    2.4 测定
    2.4.1 GC-MS条件
    色谱柱：柱长30m，内径0.25mm，甲基苯基聚硅氧烷涂层，膜厚0.25μm；载气：氦气，流速为1.3mL/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；升温程序：起始温度75℃，持续1.0min，以30℃/min升温至300℃，保持2.0min；传输线温度：280℃；运行时间：10.5min；扫描范围：60～400m/z；扫描模式：选择离子扫描，监测离子99m/z、171m/z、327m/z、342m/z；离子源温度：230℃；EI源轰击能：70eV。
    2.4.2 测定
    定性方法：试样与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%，特征离子丰度与标准品相差不大于20%。定量方法：以342、327、171和99峰面积之和进行单点校正定量。
    2.4.3 结果计算和表述
    试样中三聚氰胺的含量X，以质量分数mg/kg表示，单点校正按以下公式计算：

    X＝

    式中：
    A－试样溶液对应的色谱峰面积响应值；
    As－三聚氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值；
    Cs－标准工作液中三聚氰胺的浓度，单位为μg/mL；
    V－用于衍生的试样溶液体积（5.3），单位为mL；
    m－试样质量，单位为g；
    n－稀释倍数。

表1  三聚氰胺标准品离散系数      %

序号	1	2	3	4	5	6	7	8
峰面积值	9 616 036	9 612 508	9 630 625	9 655 693	9 599 612	9 637 895	9 533 562	9 658 409
平均值 标准偏差 离散系数	9 621 417 41 725 0.43

表2  方法回收率与相对标准偏差      %

添加量 /（mg/kg）	回收率								平均 回收率	标准偏差
	1	2	3	4	5	6	7	8
2 5 10 25	91.8 96.2 95.7 98.3	93.2 95.8 97.8 97.6	94.5 93.8 98.2 99.1	92.9 94.6 98.1 98.2	94.8 93.7 97.6 97.9	93.6 94.9 98.9 98.5	92.7 95.3 98.6 98.5	91.7 96.6 98.4 98.7	93.2 95.1 97.9 98.4	1.06 1.00 0.92 0.44

    3 结果讨论
    3.1 样品加入50mL三氯乙酸溶液，再加入2mL乙酸铅溶液，样品的最终稀释倍数是52倍。
    3.2 因为三聚氰胺微溶于水中和甲醇中，所以样品加入三氯乙酸溶液后提取时间要充分，涡旋与超声提取的时间均不宜过短，超声提取后应再次涡旋混合均匀。
    3.3 通过表1可以看出，三聚氰胺标准品的离散系数为0.43%，表明此方法重复性好。
    3.4 通过三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱与质谱图中显示，三聚氰胺的出峰时间约在7.0min左右，但在实际检测中，每一进针时间不宜低于10.5min；利用载气流动相（氦气）的冲洗，可以将色谱柱中的残留物冲洗干净，以利于下一进针样品减少杂峰的出现。
    3.5 通过表2可以看出，三聚氰胺在饲料中的回收率在93.2%～98.4%，当添加浓度低时，回收率也会相应降低，当添加浓度提高时，回收率也随之升高；添加量在2mg/kg以上时，回收率基本上稳定在93%以上，添加量高于25mg/kg时，回收率的变化不会太大，基本上也稳定在98%～110%；但当添加量小于0.05mg/kg时，回收率会降至80%以下，甚至更低，而且会出现被测样品杂峰高于三聚氰胺峰的现象；通过回收率的测定值也可以证明此方法具有很好的可行性。
    3.6 此方法操作简单易行，单一样品的检测时间在30min左右，样品的提取也不是很复杂，还具有较高回收率与低离散系数等优点，并且本方法在样品处理液进行衍生时采用以乙腈代替吡啶的试验，也收到了很好的效果，减小了有机试剂对饲料检测人员的伤害，并且也可减小对环境的污染。
    3.7 在三聚氰胺样品处理液过混合型阳离子交换萃取柱时，过滤速度不宜太快，速度宜保持稳定；用氨化甲醇洗脱时，残留于混合型阳离子交换萃取柱中的溶液应尽量抽干；在实际检测中，有时会遇到样品处理液极难通过固相萃取柱，此种情况可能是被处理样品中含有较高的脂肪所造成的；这时就不宜再用3mL水来洗涤固相萃取柱，而改用50%甲醇水溶液3mL来预洗，再用纯甲醇3mL洗涤。
    3.8 试样溶液在被氮气吹干时，氮吹仪的温度不可过高，否则吹干后的试管壁颜色发黑；加入乙腈与衍生剂后，涡旋时间不宜过短。
    3.9 试样溶液在通过0.45μm有机滤膜过滤后，如果颜色混浊可以用滤膜再过滤一次，或者通过离心机离心使溶液清辙后再过滤0.45μm有机滤膜。
    3.10 三聚氰胺在上机检测之前，应将仪器充分预热，会较好的提高检测回收率与降低离散系数。
    3.11 每一针样品检测完毕后，应用乙腈充分清洗自动进样针，可以减小样品间的相互污染问题。
    3.12 回收率的测定按照公式进行计算，但不除以样品质量（即公式中m值）；回收率是以添加的三聚氰胺标准中间液（3.12.2），浓度为100μg/mL的标准点添加到被测试样中；测定计算的标准品峰面积值（公式中的As值）是按照表1中标准品平均峰面积值进行比较计算的；此方法为外标定量法，具体参照中国国家农业行业标准“NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺的测定”中气相色谱串联质谱法的规定进行。
    3.13 标准品中三聚氰胺的出峰保留时间是在7.00min，当检测饲料样品时，饲料样品的保留时间与标准品的保留时间相对偏差不能大于0.5%，并且饲料样品的监测离子171m/z、327m/z、342m/z应与99m/z相比较，比例应当正常（参照标准品的监测离子比例）；如果出峰时间超出偏差并且监测离子比例不当，应考虑不是三聚氰胺峰，而是样品杂峰。
    3.14 以气相色谱串联质谱法（GC-MS）与高效液相色谱法（HPLC）检测饲料中的三聚氰胺相比较时，GC-MS法最低检出限为0.05mg/kg，HPLC法最低检出限为2.0mg/kg，GC-MS法灵敏度要好于HPLC法；不过GC-MS法衍生过程的不确定因素较多，中间人员操作因素影响也较大，所以重现性与HPLC法相比要差一些。有研究表明：用HPLC法对323批次饲料样品进行三聚氰胺的检测，检出含三聚氰胺的饲料样品为56批，检出率高达17.33%，而用GC-MS法只检出8批次，检出率仅为2.47%，造成这种偏差的原因可能是由于饲料中的成分比较复杂，含有与三聚氰胺结构相似的物质，因此，饲料中三聚氰胺含量的检测用农业行业标准的GC-MS法较佳。
    （参考文献略）

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