关键词：高产菌株；pH值；温度；复合酶
微生物的新陈代谢过程与产酶过程是相伴随的，产酶的过程要求要在一定的条件下才能完成。良好的外界环境有利于酶的形成，比如合适的温度、通气、pH和营养条件等。酶是良好的生物催化剂，合适的外界条件能够加速酶促反应的进行。探讨酶促反应条件是合理使用酶制剂的前提，也是合理使用酶制剂所必须的。
1 材料和方法
1.1 菌株
木素木霉S6-5，黑曲霉Y7-6，枯草芽孢杆菌B5-12。
1.2 培养基
麸皮70g、豆粉5g、玉米粉9g、稻草粉3g、硝酸铵1g、营养盐10%，含水量65%～75%，灭菌备用。
1.3 酶液提取
选用S6-5、Y7-6和B5-12菌株发酵，发酵温度32℃、初始pH=5.0、接种量10%、发酵时间84h。混菌比例2∶2∶1的条件下进行混菌发酵，发酵产物于40℃下烘干，粉碎成粗粉状，混匀待用。称取干酶曲1g，加入15mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提1h，过滤得到粗酶液，用相同的缓冲液适当稀释测定酶活。
1.4 酶活测定
1.4.1 CMC酶活力的测定（DNS法）
以CMC-Na作为反应底物，在一定温度、pH值等条件下发生酶促反应，以反应液中还原糖的增加量表示酶活力。CMC酶活力的定义：一定的pH值和温度条件下，每克样品每分钟分解CMC-Na生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位（U/g）。
1.4.2 蛋白酶活力的测定（福林试剂法）
以酪蛋白为底物，在一定温度、pH值等条件下发生酶促反应，以反应液中酪氨酸的增加量表示酶活力。蛋白酶活力的定义：在一定的温度和pH值条件下，每克样品每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位（U/g）。
1.4.3 淀粉酶活力的测定（DNS法）
以淀粉为底物，在一定温度、pH值等条件下发生酶促反应，以反应液中还原糖的增加量表示酶活力。淀粉酶活力的定义：在一定的温度和pH值条件下，每克样品每分钟水解淀粉产生1mg麦芽糖所需的酶量为1个淀粉酶活力单位（U/g）。
1.4.4 脂肪酶活力的测定（滴定法）
以橄榄油为底物，在一定温度、pH值等条件下发生酶促反应，以反应液中脂肪酸的增加量表示酶活力。脂肪酶活力的定义：在一定的温度和pH值条件下，每克样品每分钟水解产生1μmol游离脂肪酸的酶量定义为1个酶活单位（U/g）。
1.5 不同pH值下的酶活
取1%CMC-Na溶液2mL，调节pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。加入适当稀释纤维素酶液1mL混匀，在40℃恒温水浴锅中催化30min后，加入DNS试剂2mL于沸水浴中显色5min，冷却至室温，测定吸光度A并计算酶活。
取2%酪蛋白溶液2mL，调节其pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。加入适当稀释酶液1mL混匀，40℃恒温水浴锅10min，取出后加入0.4mol/L三氯醋酸2mL终止反应。保温20min，取滤液1mL，再加0.4mol/LNa2CO35mL、福林试剂1mL，摇匀保温显色20min后，测吸光度A并计算酶活。
配制1.1%的淀粉溶液，调节期pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。取适当稀释酶液1mL与1.1%的预热淀粉溶液9mL混合，40℃准确反应30min，取反应液1mL，迅速与2mL的DNS溶液混合，沸水浴15min，550nm处比色。测吸光度A并计算酶活。
取0.025mol/L磷酸缓冲液5mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液4mL混合均匀，调节其pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。在40℃温度条件下保温5min，然后各加入适当稀释的酶液1mL，准确保温15min，取出后立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L氢氧化钠滴定至溶液呈粉红色为止，计算酶活。
1.6 不同温度下的酶活
选取适当稀释纤维素酶液1mL与pH5.0的CMC-Na缓冲液2mL混匀，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度条件下恒温水浴30min，取出后加入DNS试剂2mL于沸水浴中显色5min，冷却至室温。测定吸光度A计算酶活。
取2%酪蛋白1mL，调节pH至5.0，加入稀释酶液1mL混匀，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度条件下恒温水浴10min，取出后加入0.4mol/L三氯醋酸2mL终止反应，离心后取滤液1mL，加0.4mol/LNa2CO35mL、福林试剂1mL，摇匀保温显色20min后，测吸光度A并计算酶活。
配制1.1%的淀粉溶液，调节pH至5.0。取适当稀释酶液1mL与1.1%的预热淀粉溶液9mL混合，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度条件下准确反应30min，取反应液1mL，迅速与2mL的DNS溶液混合，沸水浴15min，550nm处比色。测吸光度A并计算酶活。
取0.025mol/L磷酸缓冲液5mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液4mL混合，调节pH至5.0，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度条件下保温5min，然后各加入适当稀释的酶液1mL，准确保温15min，取出后立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L氢氧化钠滴定至溶液呈粉红色为止，计算酶活。
2 结果与分析
2.1 pH值对复合酶酶促反应的影响
pH值的改变会明显改变纤维素酶的催化能力。设定酶促反应温度40℃，考察pH值变化对酶促反应的影响。由表1可知，纤维素酶催化反应最适宜的酸碱度在pH=5.0，偏酸性的反应条件接近动物肠道酸性环境，因此，可以作为饲用纤维素酶添加剂在动物肠道中继续发挥催化作用。
蛋白酶酶活在pH=6.0时酶催化能力最强，当pH低于或高于6.0都会影响其催化能力。脂肪酶和淀粉酶在pH为5.0、6.0和7.0时差别较小，因此，复合酶酶促反应的适宜pH值应该在5.0～6.0，pH=5.0时纤维素酶催化能力较强，pH=6.0时脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的催化能力较强。
表1 pH值对纤维素酶促反应影响 U/g·min
| pH值 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 |
| 纤维素酶活 蛋白酶酶活 脂肪酶酶活 淀粉酶酶活 |
7 383 54 14 210 |
7 561 102 17 256 |
12 632 348 37 321 |
6 224 462 40 341 |
4 512 360 38 319 |
2.2 温度对复合酶酶促反应的影响
温度是影响纤维素酶酶促反应的重要因素之一。设定pH=5.0的条件下温度变化对酶促反应的影响。由表2可知，当反应体系温度为60℃时，纤维素酶活力达到14 293U/g；在20℃时纤维素酶活最低，仅有6 022U/g；随着温度的升高，酶活力逐渐增加，但在30℃、40℃和50℃时，酶活力变化不大，这可能与产酶菌种有关。Y7-6和S6-5都能够产生高活力的纤维素酶，由于每个菌种产生的纤维素酶的性质有所不同，因此造成了从30～50℃酶催化能力变化不大。作为饲用酶，40℃的催化条件可以延续酶在动物肠道中的催化作用。因此，如果在饲料预混时添加酶制剂，应该选择60℃的温度，这样可以减少添加量，增加饲料的营养价值。
蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的催化能力随着温度的升高而增加，当反应体系的温度达到50℃时蛋白酶的催化能力最高，60℃时酶活力显著降低；而脂肪酶和淀粉酶也在50℃时催化能力最强，但在60℃催化能力下降不明显。综合分析各因素，复合酶酶促反应的适宜温度是50～60℃。
表2 反应温度对纤维素酶促反应的影响 U/g·min
| 温度/℃ | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 纤维素酶活 蛋白酶酶活 脂肪酶酶活 淀粉酶酶活 |
6 022 199 16 182 |
10 363 325 29 231 |
10 906 402 42 308 |
12 632 511 45 398 |
14 293 355 37 367 |
3 结论
饲用复合酶制剂的主要酶种包括纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。在探讨复合酶中各种酶的适宜催化条件时发现，纤维素酶催化反应最适宜的酸碱度在pH=5.0，当反应体系温度为60℃时，纤维素酶活力达到14293U/g；蛋白酶酶活在pH=6.0时酶催化能力最强，当pH低于或高于6.0都会影响酶的催化能力；脂肪酶和淀粉酶的酶活在pH为5.0、6.0和7.0时差别较小。
蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的催化能力随着温度的升高而增加，当反应体系的温度达到50℃时蛋白酶的催化能力最高，60℃时酶活力显著降低；而脂肪酶和淀粉酶也在50℃时催化能力最强，但在60℃催化能力下降不明显。
因此，复合酶酶促反应的适宜pH值应该在5.0～6.0，适宜的温度是50～60℃。
（参考文献略） 饲料广角
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