摘 要：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是猪群中的一种免疫抑制性传染病，是严重危害我国养猪业的主要疫病之一，应用各种诊断技术对该病做出准确的诊断是预防和控制该病的前提。PRRS诊断技术包括检测病毒、检测血清抗体技术及分型诊断，涉及的技术和方法包括病毒分离、免疫组化、RTPCR、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、酶联免疫吸附试验和基因芯片技术等。每种诊断技术都有其各自的优势和局限性，应根据研究目的及工作条件等综合情况予以选择，文章就各种诊断技术的原理、方法及特点进行了概述和比较，并对今后的应用前景和发展趋势进行了展望。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；诊断技术；研究进展
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)所引起猪的一种高度接触性传染病。各种日龄的猪均可感染，临床上以母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为主要特征。母猪的繁殖障碍可表现为流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等，生后仔猪的死淘率增加；哺乳仔猪的呼吸道症状则表现为高热、呼吸困难等肺炎症状。该病最早于1987年报道于美国，随后在短短的几年里，在欧美各国的猪群中引发了一场空前的“流产风暴”，并迅速席卷了全球各个养猪业发达的国家和地区，给世界养猪业带来了灾难性的经济损失[13]。1991年初，我国台湾地区开始出现此病，1996年在大陆各地相继暴发和流行，并证明是美洲型PRRSV感染所致[45]。从2006年5月在我国南方猪场开始暴发至今尚未平息的猪“无名高热”病可能主要与此病有关[67]。
PRRSV感染的初步诊断可以根据母猪繁殖障碍和各年龄段出现呼吸道疾病等临床症状来确定。PRRSV感染病理变化主要表现为弥漫性间质性肺炎、淋巴结肿大、病死仔猪有时呈现胸腔积液、皮下、肌肉及腹膜下水肿。在未发生继发感染的情况下，感染猪一般不表现为肉眼可见的病理变化。由于与细小病毒、伪狂犬病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、钩端螺旋体感染相比缺乏特征性的病变，所以需要有最终的鉴别诊断。因此，临床症状疑似PRRSV感染的猪必须以检测到其病毒抗原，病毒的基因或能分离出病毒来确诊，与此同时，血清抗体的形成也可以帮助我们进行诊断。
1 PRRSV诊断的一般原则
诊断需要依据疑似感染的动物是否有PRRSV感染的特征或者是分离出病毒，检测出PRRSV抗原或核酸，此外临床上还要有一些病理变化支持实验室诊断。但是一些疫苗免疫或持续性感染PRRSV的猪也可以检测出病毒或病毒RNA，这样当进行PRRSV诊断调查的同时都需要考虑到这些问题。从临床组织中成功的分离或检测到病毒很大程度上依靠合适的采集和正确的处理样品。一般情况下，用于病毒检测的样品要尽可能早的采集，最好是发病后7 d～10 d内，在发病的急性阶段，样品中病毒含量高易于检测，感染后期不易检测，所以组织样品中是否含有足够数量的病毒是诊断的关键因素。应无菌采取新鲜样品并立即送往实验室进行病毒分离。样品一般在4 ℃保存不超过2 d，较长时间保存则应在－70 ℃，不能长期置于－20 ℃，而且要避免反复冻融，样品运送过程中最好使用干冰或甘油。
此外，通过检测猪群血清的阳转或测定PRRSV特异性抗体滴度的上升，同样可以用于PRRSV感染的诊断。血清学结果判定之前应该了解猪群的发病历史及疫苗应用历史，因为到目前为止，还没有一种血清学方法可以区分野毒抗体和疫苗抗体。另外，血清学方法也无法确定猪群感染的时间，只有将血清学结果与流行病学调查结合起来，才能做出准确的判断。当对某个猪群进行调查诊断时，必须对病原学检测结果与血清学结果综合分析，才能比较清楚地了解特定猪场PRRS的传播特点。
2 PRRSV检测技术
2.1 病毒分离
PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages， PAM)、特定的非洲绿猴肾细胞(Marc145、CL2621等细胞)上复制，然而不是每种细胞系都适合PRRSV的生长，这也就是说，如果可能的话，需要用至少2种细胞系来进行病毒特定的分离培养。但分离欧洲株PRRSV只能用PAM细胞[8]。PRRSV可以在多种临床样品中分离得到，其中包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃腺、肺、淋巴结、脾、胸腺、心、脑、肝、睾丸和精液等，其中血清和肺灌洗液最适合病毒分离。PRRSV在血清中存在比组织中稳定，而老龄动物由于病毒血症的时间短，则病毒在组织中存在的时间长。组织必须及时送检才能保证病毒分离的成功。样品的选择同时也要根据感染的阶段(急性感染期、康复期和持续感染期)，在急性感染期，选择血清、肺、肺灌洗液作为样品比较好，而持续感染的动物则选择口、鼻棉拭及肺灌洗液较好[9]。对于迟发性流产和早产的病例，样品选择弱胎或哺乳仔猪要比木乃伊胎和流产胎儿好。虽然弱胎很可能有病毒血症，但其存在高滴度的母源抗体对病毒的分离有干扰作用。
2.2 病毒抗原的检测
冷冻组织切片荧光抗体检测和免疫组化可以在组织中检测病毒抗原，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。组织样品最好采集肺脏、脾脏、淋巴结、胸腺及扁桃体。冷冻切片直接或间接免疫荧光成本较低并且快速，样品的质量对冷冻组织切片荧光抗体检测的结果影响很大，组织应该取自最近死亡的动物而且要迅速冷冻。相比较而言，免疫组化法可以检测在福尔马林中保存的组织病毒，但费时费力。免疫组化法的敏感性比免疫荧光要高，但检测费用也相对较高。鉴别诊断可以根据检查PRRSV微观病变特征并与免疫组化法或免疫荧光配合检测。
2.3 病毒RNA的检测
反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction， RTPCR)已经用于临床样品的检测。由于病毒不需要经细胞培养，而是检测病毒RNA，所以RTPCR技术比病毒分离大大节省了时间，而且有着较高的特异性和敏感性[10]，此项技术已广泛应用于PRRSV的鉴定和临床诊断，并在方法上不断改进和提高。PTPCR技术扩增的目的片段主要是针对PRRSV的N蛋白基因，原因是PRRSV基因组中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)中包括所有毒株保守的共同表位和区别于欧洲型的特异性表位。另外，还可针对病毒基因组的ORF6或ORF1，目前针对ORF1编码的病毒非结构蛋白2(Nsp2)的基因序列是否缺失，可以从临床采集的样品中区分是弱毒株感染还是高致病性的变异毒株感染所引起[6,11]。精液、粪便等样品用传统方法不易检测，这样用RTPCR的方法就非常有效，而且它还可以用于胎儿组织和腹水等低含毒量样品的检测[12]。近年发展起来的实时荧光定量PCR检测技术与传统诊断方法比较具有很多突出的优点，如引物与探针可以大量合成并长期保存，检测速度快(仅需2 h～4 h)，结果准确，不易污染，敏感性更高(比常规RTPCR高100倍)，可以区分不同的毒株亚型。在PRRSV的早期检测、预防控制、出入境检疫及基础研究中发挥着重要作用[1314]。套式RTPCR技术也可以增强检测的敏感性，可以区分美洲型和欧洲型PRRSV[15]。但以上两种检测技术需要更高的成本，在实用性方面不利于推广。根据样品的性质、样品采集、实验室技术水平及检测技术的差异，不同实验室RTPCR技术的应用也会有所不同。因此，每个实验室要根据自身的条件和技术水平，建立起有自己特点RTPCR的检测技术。
应用核酸探针原位杂交技术和基因芯片技术检测PRRSV的RNA也日趋成熟，Chuch L[16]制备了地高辛探针，成功建立了敏感荧光原位杂交技术，结果PRRSV核酸在巨噬细胞内明显可见，故认为该法对PRRSV常规临床诊断及病毒持续性感染研究有重要意义。高淑霞等[17]报道将PRRSV、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的保守序列构建重组质粒制备探针，并将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维膜上并加以固定，制备低密度基因芯片。与RTPCR方法相比，显示了较高的灵敏度。该方法的建立，为大批量快速诊断、普查猪病毒性繁殖障碍性疾病提供了有效的鉴别诊断手段，但鉴于成本因素，与实际应用还有一定的距离。
3 PRRSV血清抗体检测
PRRSV特异性抗体的诊断方法主要有间接免疫荧光(indirect fluorescence assay， IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay， IPMA)、酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay， ELISA)、病毒中和试验(serum virus neutralization， SVN)和乳胶凝集试验(latex agglutination test， LAT)。其中IFA、SVN和ELISA在美洲诊断实验室应用较多，而欧洲主要用IPMA检测PRRSV抗体。血清学试验的结果受到检测用分离病毒与感染猪病毒相关性的影响。
3.1 间接免疫荧光试验
间接免疫荧光试验(IFA)特异性可达99%，敏感性不是很清楚。IFA可以确定抗体的滴度。参照试验起始时血清的稀释度，抗体滴度达到16或20的可以判为阳性。在动物感染后2月～3月IFA检测的结果比较可靠。在试验感染条件下，通过IFA方法可在感染后5 d～9 d检测到抗体，抗体在30 d～50 d出现高峰，随后抗体滴度逐渐下降，在感染后4个～5个月消失[18]。
3.2 免疫过氧化物酶单层细胞试验
IPMA具备高特异性和敏感性，其敏感性要比ELISA高。IPMA经常用于感染后7 d～15 d PRRSV的检测。与IFA一样，IPMA同样在感染后2个～3个月检测比较可靠。这种于1991年建立的PRRSV血清抗体检测法，至今仍是欧美国家广泛使用的血清学诊断方法。IPMA在PRRSV感染后9 d～11 d可检测到抗体，在35 d～50 d抗体水平达到高峰，在感染后11个～12个月抗体消失[18]。谭斌等[19]建立一种检测PRRSV血清抗体的IPMA，并组装成PRRSVIPMA抗体检测试剂盒，检测临床中的血清样本，与IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83.3%。
3.3 酶联免疫吸附试验
ELISA同样也有着很好的特异性和敏感性，对于早期抗体的检测比用IPMA更为敏感。ELISA检测方法有多种形式，即间接ELISA、捕捉ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA等。美国IDEXX公司的商品化ELISA试剂盒检测的特异性能达到98%～99%，现在又推出检测性能更好的第2代产品。商品化的试剂盒有高度的一致性，自动化程度高等特点，现已成为国际上血清学检测的主要标准，许多新建血清学检测方法都与此为标准检测符合率。有的可以同时检测出美洲型和欧洲型，而且快速简便。
3.4 病毒中和试验
SVN也具有高度特异性，但其敏感性不如ELISA。其低的敏感性主要由于中和抗体要在敏感后1个～2个月后才能产生。SVN只能说是一种较好的研究方法，它非常费时费力，不适用于日常的PRRSV的诊断，但在所有血清学检测方法中，此法是评价猪群的免疫保护水平的惟一客观可信的方法。有研究表明，当猪群中中和抗体的平均水平大于1∶24才能免受PRRSV的攻击，否则将促进病毒在猪群中的增殖和扩散[20]。
3.5 乳胶凝集试验
王忠田等[21]利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原，成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测，具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测，结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%，与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87%，检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点，故是一种适合基层兽医单位检测PRRSV血清抗体的新方法。
4 PRRSV分型诊断技术
4.1 单克隆抗体技术
单克隆抗体技术可以用于鉴定不同来源毒株的抗原表位，由于PRRSV单抗与PRRSV不同的结构蛋白有不同的反应特性，其中有的单抗能够与所有毒株反应，有的则只与欧、美洲型毒株中1个型发生反应，因此运用单克隆抗体可以很容易的区别PRRSV的美洲型和欧洲型。Nelson等使用单抗进行研究，发现1995年以前美国中西部猪场没有欧洲型或类欧洲型的感染，但最近发现美国有欧洲型PRRSV的流行。单抗技术不仅可以用于病毒的分型，同样可以区分野毒株和疫苗株[22]。然而，目前血清学试验不能区分是野毒抗体，还是灭活疫苗接种产生的疫苗抗体，最近Nsp2单抗的问世及其丰富的B细胞表位的鉴定[23]，相信在不久的将来将会有快捷简便的血清学鉴别技术诞生。
4.2 限制性酶切片段多肽性分析
限制性酶切片段多肽性分析(restriction fragment length polymorphism， RFLP)能粗略的区分PRRSV分离株。此技术一开始建立作为PRRS的一项诊断技术，现在发现并不实用。RELP是应用限制性核酸内切酶对病毒核酸进行消化，这样不同的病毒核酸就会被切割成不同的大小，不同片段的长度是病毒特征性的标志，可以依靠这一点进行检测。然而，切割片段与病毒粒子特异性的特征，如致病性、抗原的相关性等都没有什么直接的联系，也就是说这限制了其结果的实用性，而且其切割部分只是整个基因组很少的一部分。2002年建立起来的异源双链分子迁移性检测技术可以快速区分疫苗或野毒感染，但其应用也有一定的局限性[24]。
4.3 基因序列分析
基因序列分析也是一种在基因水平上鉴别病毒的方法。对于兽医工作者来说，序列的分析和比较是进行病毒分子流行学调查的一个很好的方法。应用序列分析可以在分子水平上分析不同毒株间的相关性，直接了解核苷酸的插入、缺失或突变等变化，因而可以分析在一定时段内病毒在猪群间传播的背景。而且序列测定有助于区分疫苗株和野毒株，可以分析某地区，某一时间内病毒的变异情况，绘制进化树。
大量临床研究显示PRRSV基因型有着显著的变化[25]，这也说明病毒是在不停的进化的，实验室条件下进行的PRRSV的突变情况并不能解释观察的结果。在试验条件下，祖代与突变传代病毒之间的序列差异不到1%，而在临床上差异能达到15%以上[26]。尽管序列分析对病毒型相关性评价是很好的工具，但有些问题如毒株的来源、致病性和生物学特性等疑问并不能通过序列测定得到合理的解释。也就是说，还不能通过基因序列的信息来描述出病毒的起源、潜在的致病能力或一些生物学特性。而且，如果分离株与疫苗株有着相似的基因序列，也不能准确地预测疫苗的效果或根据序列结果来筛选疫苗毒株。
另外，运用PCR也可以对PRRSV进行分型。现在已经建立起RTPCR技术来区分美洲型和欧洲型病毒，近来不少实验室都建立起可以区分美洲型和欧洲型的RTPCR技术，同时也有应用荧光定量技术，更加提高了检测性能。
总之，PRRS给当前养猪业造成了严重的危害，通过不同检测技术对PRRS进行确诊及监测是防控该病的重要环节。在临床应用过程中，有必要充分考虑每种诊断方法的优点及局限性，根据研究目的需要以及试验条件等综合情况来选择确定检测方法，这样才能更好地发挥各种诊断技术自身的特点，准确地诊断疾病并制定出合理的预防控制措施。
作者： 严玉霖等 文章来源：动物医学进展
