酪蛋白磷酸肽(CPP)与钙、铁营养研究进展

     目前，研究较为广泛的生物活性肽主要来源于牛乳酪蛋白，这类肽具有免疫、镇痛、促进矿物质吸收等诸多生物功能。其中，研究较多的是酪蛋白磷酸肽(CPP)，它是以牛乳酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽，具有结合钙和促进钙吸收的功能，同时对提高铁的生物利用率也有作用。

    1 CPP的来源与分子结构

     酪蛋白占牛乳总蛋白的80%左右，主要有αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白组成。CPP主要是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白，β-酪蛋白经胰蛋白酶水解后，产生的相对分子量不均一，且富含Ser-P的多肽。理论上可产生8种磷酸肽，其中最为典型的有以下4种。

    sequence 1 [β-CN(1-25)]：

    Arg1-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser（P）-Leu-Ser（P）3-Glu2-Ser-Ile-Thr-Arg25。

    sequence 2 [αs1-CN(59-79)]：

    Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)3-Glu2-Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys79。

    sequence 3 [αs2-CN(46-70)]：

    Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)3-Glu2-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu- Val-Lys70。

    sequence 4 [αs2-CN(1-21)]：

    Lys1-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)3-Glu2-Ser-Ile-Ile-Ser(P)-Gln-Glu -Thr-Tyr-Lys21。

     其结构特点含有共同的核心部位是SerP-SerP-SerP-Glu-Glu。这一核心部位是CPP发挥生物功能的关键区域，可以与钙、铁等二价离子结合，同时磷酸丝氨酸基上含有的负电荷可以阻止CPP在肠道内被消化酶降解。

    2 CPP与钙、铁的营养

    2.1 CPP与钙的营养

     CPP最早是作为促钙吸收因子而被发现的。钙是动物体内矿物质营养中需求量最大的一种常量元素,在维持机体构造和生理机能中起着重要作用,也是细胞和血液的主要生理活性物质。由于饲料中含有大量的植酸盐、纤维素、草酸等,它们可以与Ca2+结合生成不溶性沉淀物质,从而抑制了动物对钙的吸收利用。因此,在生产中除了寻求良好的钙补充制剂外,提高现有钙的吸收也是一项很有意义的措施。CPP促进动物对钙的吸收主要表现在3个方面：小肠、骨骼和牙齿。

    2.1.1 CPP促进小肠对钙的吸收

     已经有大量的动物试验研究表明,CPP可以增加小肠末端Ca2+的浓度,促进小肠对钙的吸收。Reeves等(1958)用动物试验证明了CPP可以在中性或偏碱性条件下阻止钙的沉淀，从而促进钙在小肠中的吸收。Y. S. Lee等(1983)进一步研究证明CPP可增加大鼠小肠末端可溶性钙的含量。 Y. S. Tome等(1992)报道，添加CPP的日粮很大程度上提高了机体内的钙平衡，降低钙的排泄。但是也有报告认为,添加CPP对钙的吸收没有促进作用或作用效果不显著(Scholz-Ahrens等,2000；Camara-Martos等，2002；Bouhallab等，2004)。这种不一致的结果可能是由于试验设计不同，主要包括试验模型的选择、动物的年龄、体内钙况、日粮成分、商品CPP的组成、纯度不同。另外，添加外源CPP与钙在胃肠内相互作用也是产生不一致结果的关键因素。由于液态乳中钙的理化状态不同，在消化高钙乳和常乳时,CPP与矿物质的相互作用就不同。高钙乳中钙主要以离子的形式存在，而常乳中的钙大部分以结合形式存在。H. Tsuchita 等(2001)研究了在大鼠日粮中添加外源CPP对饲喂高钙乳(2.7 g/kg)中钙吸收的影响，以胃肠钙的消失量[摄入钙-（胃钙+肠钙）]做为钙吸收的间接判定依据,当饲喂大鼠高钙乳时,添加不同水平的外源CPP,胃肠钙消失量在30 min和60 min时显著高于不添加CPP组（P<0.05）,说明CPP可以和高钙乳中的Ca2+相互作用，提高其在小肠中的溶解性，以增加小肠末端中可溶性钙的含量。尽管胃肠钙消失量与钙表观吸收并不相等，但可以反映出胃肠钙消失越多，则钙吸收也越多。常乳中钙的理化性质能影响其与CPP的相互作用。在另一个试验中,当饲喂常乳(1.35 g/kg)时,与对照组相比,试验组添加CPP对肠内可溶性钙的增加和胃肠钙消失量并无显著性的影响。原因之一可能是添加到常乳中的CPP被胃排空的速度快于从乳中释放的钙的速度(Holt和 Hukins,1991)；或者，常乳中以蛋白水解物结合形式的钙直接从胃内排空，因此与外源CPP无相互作用。增加Ca2+的可溶性是CPP促进小肠钙吸收的重要机制，在CPP与钙由胃排空进入小肠的同时，小肠内CPP很容易与钙相互作用。当所有的日粮钙预先与CPP结合后，钙的利用率提高（Tsuchita，1996），而饲粮中其它成分的干扰都会减弱CPP与钙的相互作用。以上研究表明，添加外源CPP对钙吸收的影响依赖于日粮中钙的存在形式及胃、肠内钙与CPP的相互作用。

     另外，分子结构决定生物功能，CPP核心结构上的丝氨酸磷酸基带有的负电荷在肠腔内与Ca2+有较强的亲和性，从而结合形成可溶性的复合物以促进肠上皮细胞对钙的吸收利用。Anita Ferraretto等（2001）研究表明，在不考虑CPP增加小肠可溶性钙含量的情况下研究CPP与细胞膜的直接作用发现，CPP并不影响膜结合受体或离子通道，而作用方式可能是CPP直接嵌入到细胞膜中形成特殊的Ca2+选择性通道，或者是作为一种钙载体肽经过细胞膜内吞或其它过程而迅速内陷，使Ca2+进入细胞溶质中。由CPP引起的细胞溶质中钙的上升主要是依赖于CPP的剂量和细胞的数量。

    为了更清楚了解CPP的作用功能，确定CPP对动物的最佳添加量，进一步对CPP的N与P、CPP与Ca的最佳比例进行了研究。CPP的N与P摩尔比可反映CPP的纯度和磷酸基的密度,N与P比值低则纯度或磷酸基密度较高，结合钙的能力也强。冯玉琴等(1997)探讨了CPP的N与P比值大小与结合钙的能力之间关系发现，N与P摩尔比越小，则CPP制品中核心结构区域（即相连的3个磷酸丝氨酰及两个谷氨酰残基）所占的比例越大，CPP结合钙的能力越强；随后又说明CPP作用效果不仅与N与P比值有关，还与分子中核心区域以外的氨基酸组成和顺序有关。胡志和(2001)研究CPP阻止钙沉淀的活性与酪蛋白水解度之间的关系发现，当酶与底物比不同时，所得CPP的N与P比值不同；N与P比值不同，其CPP阻止钙沉淀的活性也不同。另外，N与P比值不能太小，因为从酪蛋白与酶的水解物中分离纯化出来CPP分子中，成簇存在的磷酸基在反应pH值条件下带负电荷,可阻止酶的进一步水解。Daniela Erba 等(2002)报道，CPP对钙的被动吸收有积极作用，且依赖于小肠内CPP和钙的相对数量，试验结果表明，CPP与Ca比例为0.37时对提高矿物元素运输是最有效的。Y. Saito等(1998)研究表明，雄性大鼠日粮CPP与Ca比值为0.2时，小肠钙表观吸收率、钙储留率、可溶性钙含量与对照组相比显著提高（P<0.05），CPP最小有效剂量为0.7 g/kg。另外，Bennett等(2000)分别给大鼠饲喂100、200、350、500 g/kg的CPP，试验发现，100 g/kg剂量组钙吸收和骨沉积与对照组相比无显著差异，而200、350、500 g/kg剂量组却降低了钙吸收和骨沉积，说明高剂量的CPP反而抑制钙的吸收利用。分析可能的原因：①过量的CPP可能与Ca2+螯合形成一种可以隐藏Ca2+的分子量更大的复合物，减少了Ca2+的释放，从而降低了钙的生物利用率，如Li等（1989）在大鼠回肠中发现，CPP与Ca结合成的复合物不能被吸收且存留在小肠粘膜上；②过量的CPP可增加P与Ca比值，当CPP由0到500 g/kg时，P与Ca比值就会由0.8：1增加到4.3：1。Howe和Beecher（1981）认为，当日粮磷含量上升时，会降低钙的吸收。

    2．1．2 促进骨对钙的利用

     大量动物试验表明，CPP可提高钙在骨中的储留，能促进骨骼对钙的利用，减弱破骨细胞作用及抑制骨的再吸收。Sato等（1986）指出，当老鼠的饮食中含CPP或酪蛋白时，将会增加大腿骨组织中放射线标记的钙含量。K. Ashida等（1994）报道，饲喂正常钙日粮的来航鸡，添加CPP后可提高骨质量和骨灰分含量。另有试验表明，CPP可降低骨发育异常的发病率，可缓解骨病的发生。Yamaguchi等（1998）报道，日粮中添加CPP可缓解卵巢切除的大鼠骨的损失。Zhong Jie Ma等（2000）研究了异黄酮和CPP对青年和老龄大鼠骨形成的协同效应，结果表明，异黄酮和CPP同时添加时，对青年和老龄大鼠股骨的形成具有增效作用；单独添加CPP时，大鼠股骨骨干和干骺端的碱性磷酸酶活性和DNA含量与对照组（两者均不添加时）相比无显著差异。碱性磷酸酶参与骨的形成，DNA含量是骨骼生长和骨细胞数量的标志。试验说明，CPP与异黄酮的作用方式不同,它是通过增加小肠钙的吸收而促进骨中钙的沉积的，对成骨细胞的分化具有间接作用。因此，CPP在骨骼的形成中是作为一种促进骨矿化的因子,而异黄酮有类雌激素的作用，可抑制骨的吸收，两者结合使用可治疗临床骨质疏松症。

    2.1.3 抗龋齿、促进牙齿中钙的沉积和钙化

     近年来的大量研究发现，乳酪中含有的CPP能将食物中的Ca2+给合到龋齿处，减轻釉质的去矿物质化，达到抗龋齿的目的。Reynolds（1998）研究表明，CPP在溶液中能与钙、磷结合成复合体，即酪蛋白磷酸肽钙磷复合体（CPP-ACP），促使钙离子进入龋损区，使早期龋损再矿化，具有防龋功能。此结果在人磨牙釉质上用显微放射照相技术和显微光密度计得到证实。

     CPP与钙、磷结合成不稳定的复合物，固定于牙齿表面，CPP的疏水链连接在牙菌斑和口腔粘膜上。酸性物质（pH值<5.5）一方面会引起牙齿表面脱矿；另一方面可使CPP-ACP解离，并形成自由的钙离子和磷酸根离子。磷酸丝氨酸钙盐可提供由游离的Ca2+和PO43-构成的缓冲液，使溶液达到过饱和并沉积在牙齿表面，而过饱和的Ca2+和PO43-在牙齿表面则引起再矿化，以抵制细菌的侵蚀和脱矿作用。

    CPP-ACP加氟形成酪蛋白磷酸肽钙氟磷复合体（CPP-ACFP）。Cross等用核磁共振光谱分析和X射线测定CPP-ACFP，证明是由CPP的功能结构αs1-CN（59-79）与ACFP结合，形成半径为（2.12+0.26）nm的无定形的毫微簇。研究显示，这种毫微簇中每一个缩氨酸结合15个钙离子、9个磷酸根、3个氟离子。CPP-ACFP对釉质龋损的矿化作用相当明显，因此，CPP可能是运送钙、磷、氟至牙齿的良好载体。CPP-ACFP的抗龋机制可能是CPP使ACP和ACFP固定于牙齿表面，即固定部分钙、磷、氟于牙齿表面，因而缓冲牙菌斑pH值，降低釉质脱矿，增强其再矿化，也可做牙膏的添加剂，以改善其防龋效果。

    2.2 促进铁的吸收

     铁缺乏是全世界普遍存在的营养问题之一，一味补钙反而加重铁的缺乏。Sato等(1991)研究认为，CPP通过增加无机铁的溶解性促进铁在肠道中的吸收。牟光庆等（2001）通过动物试验研究了CPP对铁吸收的影响，其试验结果表明，饲喂添加FeSO4和0.1%CPP的饲料和仅添加FeSO4的饲料对缺铁性贫血大鼠的血红蛋白、红细胞及血细胞压积的影响比饲喂缺铁性饲料大鼠的血液生化指标有较大影响，且饲喂后缺铁性贫血的大鼠血液生化指标恢复良好，并且CPP和FeSO4同时添加组的效果优于单独添加FeSO4组。Peters等（1999）报道，铁和β-CPP的结合提高了铁的吸收，减少了粘膜的储存量，无论是在正常或缺铁的情况下均促进了铁的净吸收，同时也提示至少有一种不同于铁盐的另一种铁的吸收途径，铁和β-CPP的络合物可被细胞内吞或与氨基酸、肽结合,从而提高铁的吸收利用。

     牛奶和母乳都是幼儿食品，但是与母乳相比，牛奶对铁的吸收较低。牛奶中高浓度的Ca2+和蛋白种类可能解释这种差异存在的原因。牛奶中主要的蛋白是α-酪蛋白，它能通过磷酸丝氨酸簇结合阳离子，在与Fe2+结合时，这种结合作用非常强烈（大于100倍与钙的结合能力）。这种强烈的结合作用，虽然使铁在肠道以溶解状态存在，但也阻止了十二指肠粘膜中Fe2+的释放，因而阻止了铁的吸收。经酶水解不同的酪蛋白所释放的CPP，对铁的吸收也会产生不同的影响。Kibangou等（2005）研究不同来源的CPP对铁吸收的影响发现，来自α-酪蛋白的CPP与铁结合成复合物对铁的摄入和净吸收显著低于铁-β-CPP组。当铁与β-CPP结合后，小肠磷酸酶能显著增加铁的摄入和吸收，并且不影响其它形式铁，所以β-酪蛋白和β-CPP能促进铁的吸收。产生这种差异可能是不同CPP且有不同的结构与构象特征，铁与αs1-CPP结合可能减少其与消化酶接近的机会，而β-CPP结合铁后能使离子态的铁更好的吸收，具体机理有待进一步研究。牛乳和人乳中蛋白种类的不同（即人乳中不含α-酪蛋白），可能解释了它们对铁生物利用率影响的差异。

    3 CPP在动物营养上的应用

     目前CPP主要是作为一种促进矿物离子吸收的功能性饲料添加剂在动物生产中得到应用。Nakajima等(1994)报道，3～6周龄饲养期后，在产蛋鸡低钙日粮中添加1.0%CPP后,可提高蛋壳比重,改善蛋壳破碎程度。Ashida等(1996)试验证明，在正常钙水平日粮中添加CPP可增强蛋鸡骨骼的强度，提高骨质量和骨灰分含量；在低钙水平日粮中添加0.5%～1.0%的CPP可改善蛋壳的品质。G. B.Parkinson等(2004)报道，给育肥仔鸡添加CPP，仔鸡胫骨异常发病率下降。CPP还可以作为一种免疫增强剂用于生产中，在仔猪日粮中添加CPP可以明显地提高IgG、IgA和IgM抗体的水平，从而增强仔猪的免疫力。Otani等(2000)在3周龄仔猪日粮中添加0.5%的CPP，经过5周饲养发现，对体增重无明显影响，但是提高了血清和粪便中IgG和IgM的水平，对乳球蛋白特异的IgA比对照组要高得多。Kitamura等(2002)给母猪饲喂0．5％CPP-I，试验期为母猪分娩前2个月至仔猪断奶的当天，1个月后发现,试验组母猪粪便中IgA的含量明显高于对照组(只添加等量的卵白蛋白)，试验组母猪在分娩前1月和l周，其血清IgG的含量都是升高的。分娩当天母猪乳汁中IgA和IgG含量比对照组分别提高了1．5％和1．7%，差异显著。出生10 d后的试验组仔猪血清IgG含量比对照组稍高；达到110 kg体重所需平均天数为186 d，优于对照组(196 d)。这一研究进一步说明，通过给母猪添加CPP-I可以提高仔猪的生长性能。Otani等(2000)认为，CPP-I在仔猪和母猪饲料中的添加量为0．5％比较合适。另外，通过对牛、猪体外试验表明，CPP可明显促进精子进入卵细胞的能力和体外精卵细胞的融合，从而提高卵细胞的受精率（Nagai，1996；Mori，1996）。原因是CPP促进精子对钙离子的吸收，增强精子顶体的反应能力，提高精子对卵细胞的穿透能力。 Kreysing等（1997）在BO的介质中，使牛的成熟卵母细胞在体外受精，结果添加与不添加CPP的精子的穿透率分别为43.9%和20.7%，多精入卵率分别为5.2%和2.9%，分裂率分别为41%和25%，发育成胚泡的机率为13%和6%。

    4 CPP在动物生产上有待解决的问题

     CPP作为一种活性多肽，由于其稳定性好、安全、具有多种生物功能，已作为功能性营养添加剂在发达国家得到应用，并对它在动物营养上的研究与应用进行了尝试。CPP在畜牧生产中有待进一步研究的问题：

     ①　CPP与植酸酶结合使用。植酸酶可使植酸分解释放出磷酸根，而CPP可阻止磷酸根与钙离子形成磷酸钙沉淀，二者结合使用有可能提高钙、磷的吸收，提高植酸酶的添加效应。

     ②　从分子水平深入探讨CPP促进矿物质吸收的全过程。

     ③　用于制药和特定生理阶段动物的保健饲料。如用于对佝偻病、骨质疏松症等疾病的治疗，制成CPP-Ca的复合物用于治疗和预防佝偻病；CPP-Fe的复合物用于防治贫血；CPP-Zn用于防治因缺乏Zn而引起的各种畜禽缺乏疾病。也可直接将其添加于饲料中，以满足畜禽对钙铁等矿物元素的需求，并防止相应的缺乏症。

    来源：《饲料工业》 作者： 段俊红 王之盛 周安国