高效液相色谱法测定饲料中磺胺喹恶啉方法研究

         磺胺喹恶啉属磺胺类抗生素兼有抗球虫作用，广泛用于养禽业，其口服后吸收迅速，但排泄缓慢，残留在组织器官及鸡蛋中时间长，人食用后，对人体产生耐药性等副作用。世界卫生组织(WHO)规定动物组织、奶的最高残留限量(MRL)值为100μg/kg。日本等国规定肉鸡中不得检出。因此，该药的使用应严格控制用药期及用药量，以保证产品的安全及对外贸易畅通。
　　据英国兽药典记载，磺胺喹恶啉纯品为黄色粉末，几乎无味，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于碱性溶液。目前，饲料中磺胺喹恶啉的检测方法美国AOAC标准是采用分光光度法，该法要求含阿散酸及不含阿散酸的饲料采用两种不同的测定方法。而国内饲料目前添加组分较复杂，检测者对饲料情况是未知的，难以确定用哪一个方法；且该方法中需要重氮化试剂做偶合反应，其毒性大，对操作者及环境 都会造成危害。因此，我们没有采用该法。另外，还有文献报道用气相色谱法测定，中间仍需重氮化衍生。我们最终选用高效液相色谱法。
　　
　　1.测定方法 
　　1.1原理 用甲醇水溶液提取饲料中的磺胺喹恶啉，离心，过滤，在HPLC仪上分离,紫外检测器240nm处测定。
　　1.2 试剂和溶液
　　以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682规定的一级水。
　　1.2.1 磺胺喹恶啉标准品：含磺胺喹恶啉(C14H12N4O2S) 95.0％。
　　1.2.2 甲醇：色谱纯。
　　1.2.3 磷酸盐溶液：取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钾5.71g，加水溶解并稀释至1000mL。
　　1.2.4 磺胺喹恶啉标准溶液：准确称取磺胺喹恶啉(4.1)50mg，溶于甲醇并稀释成0.1mg/mL的储备液，置4℃冰箱中避光保存，有效期1个月。临用前，取此储备液用水稀释成适当浓度的标准工作液。
　　1.2.5 提取液：甲醇100mL＋水50mL
　　1.3 仪器
　　1.3.1 实验室常用仪器设备 
　　1.3.2高效液相色谱仪(配紫外检测器)
　　1.3.3 分析天平：感量为0.0001g和0.001g
　　1.3.4 旋涡振荡器
　　1.3.5 离心机：4000r/min
　　1.3.6针头过滤器：备孔径为0.45μm 微孔滤膜
　　1.4 分析步骤
　　1.4.1 提取
　　称取5g试样，精确至0.001g，加入提取液(4.5)50mL，旋涡振荡器混匀，超声水浴中提取15min，中间取出摇动1次，然后4000r/min离心5min，静置，取上清液过0.45μm滤膜，供液相色谱测定。
　　1.4.2 标准曲线的制备
　　准确吸取储备液适量，用水或流动相稀释成浓度分别为0.10、0.50、1.00、2.00、10.0μg/mL的磺胺喹恶啉标准溶液，做出标准曲线。
　　1.4.3 测定
　　1.4.3.1 色谱条件
　　色谱柱：C18柱 柱长150mm，柱内径4.6mm，粒度5μm或性能相当者。
　　流动相：磷酸盐溶液75mL＋甲醇25mL，用前过0.45μm滤膜，并超声脱气。
　　流速：1mL/min。
　　检测波长：240nm。
　　进样量：10～20μL。
　　1.4.3.2 定性与定量
　　根据标准品的保留时间定性，定量由标准曲线或单点校准。
　　1.4.4 结果的计算
　　每千克试样中含磺胺喹恶啉的质量按下式公式计算：
   m1
x= — ×D
   m
　　x——每千克试样中磺胺喹恶啉的质量(mg)；
　　m1——色谱峰面积对应的磺胺喹恶啉的质量(μg)；
　　D——稀释倍数；
　　m——所称样品的质量(g)。
　　平行测定结果用算术平均值表示，保留至小数点后1位。
　　
　　2.结果与讨论
　　2. 1 色谱条件的确定
　　大多数磺胺类药物常以磷酸/乙腈体系做为流动相，而磺胺喹恶啉在该体系下出峰时间是56min，影响检测效率。改用磷酸盐/甲醇体系做流动相。
　　通过改变磷酸盐和甲醇的比例，磺胺喹恶啉的保留时间发生了变化。
　　
　　磷酸盐 : 甲醇 磺胺喹恶啉保留时间 (min)
　　 70 : 30 4.86
　　 75 : 25 7.80
　　 80 : 20 12.32

　　出峰早磺胺喹恶啉与杂质峰相互干扰，出峰晚影响检测效率，峰形变宽。磷酸盐与甲醇比例75:25较为合适。
　　2.2 方法线性与最小检出限
　　对5.0、10.0、20.0、100.0 mg/kg的添加浓度按上述方法测定。

添加浓度(mg/kg) 5.0 10.0 20.0 100.0
峰面积 35906 71684 122536 771414

　　线性方程为：y=7821.8～13601.6
　　相关系数为：r=0.9992
　　方法最小检出浓度为5.0mg/kg。磺胺喹恶啉的使用剂量鸡配合饲料是60g/t，能够检出低于用量10倍浓度已能满足检测需要。
　　2.3 方法的准确度与精密度
　　根据磺胺喹恶啉在配合饲料中允许使用量为60 mg/kg，取配合饲料分别制成5、60、100mg/kg的磺胺喹恶啉添加试样，每个浓度做5个平行，提取，上机测定，计算回收率及方法变异系数。

添加量  实测值 回收率 变异系数
(mg/kg) (mg/kg) (％)  (n=5)
  5      4.5    89.4   6.7
 60     55.6    92.6   2.1
100     95.2    95.2   4.6

　　2.4 适用范围
　　取添加剂预混合饲料及浓缩料制成添加试样，提取，适当稀释上机测定。

                添加量   实测值 回收率 变异系数
                (mg/kg) (mg/kg)  (％)   (n=5)
添加剂预混合饲料  200    190.2   95.1    5.4
添加剂预混合饲料 1500   1480.6   98.7    2.1
浓缩料            100     91.5   91.5    6.2

　　总之，通过上述实验考查，说明该方法不仅适用于配合饲料，同样也适用于浓缩及添加剂预混合饲料。
　　
　　3. 结论
　　通过上述实验考查，本方法提取操作简便、快捷，在此色谱条件下，分辨率高，干扰少，适用于配合饲料、浓缩料及添加剂预混合饲料中磺胺喹恶啉的测定。方法最小检出浓度满足实际监督检测需要，具有较好的准确度及精密度。
　　(参考文献略)