1 材料与方法
1．1 实验动物 雏鸭为购自合肥市某种鸭场DVH阴性的1日龄樱桃谷肉鸭，出壳后未接种任何疫苗，隔离饲养观察两天，无异常。6周龄雌性BALB/C小鼠由扬州大学实验动物教研室提供。?
1．2 病毒 R85952?为本研究室保存的I型DHV标准强毒株，其毒价为104.8LD50?/0.1 ml。试验前接种雏鸭进行毒株复壮，取肝毒用生理盐水按1∶10稀释研磨冻融3次，经3 000 r/min离心15 min，取上清液加入青霉素、链霉素各1 000 IU(μg)/ml，置37℃温箱中作用1 h备用。?
1．3 鼠抗DHV A66?株高免血清的制备将DHV A66?株按文献的方法进行纯化、测定蛋白质浓度，并按文献制备单抗的程序免疫BALB/C小鼠、分离血清、检测抗体滴度。?
1．4 试验用血清和酶标抗体 正常BALB/C小鼠血清由安徽省医学科学研究所病毒室提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。?
1．5 检测石蜡切片中DHV的免疫酶组化技术的建立??
1．5．1 待检组织石蜡切片的制备 按文献［4］的方法略加改进。取待检组织块置10%中性福尔马固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每份样品制备3～5 μm厚的蜡片2张以上，分别供免疫酶复染和常规H.E.染色，浸蜡和烘片过程控制在60℃以下。?
1．5．2 免疫酶组化技术的程序及结果判定 切片按文献［4］的程序进行免疫酶组化染色，以Harris苏木素进行衬托染色、凉干、封片后镜检。凡被检组织局部细胞胞浆内呈现棕黄色的判为阳性（+），否则判为阴性（-）。?
1．5．3 鼠源高免血清和酶标抗体工作浓度的确定 取人工感染DHV R85952?株雏鸭典型病变的肝脏制成石蜡切片作为阳性切片，将高免血清分别作1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、稀释，HRP标记的羊抗鼠IgG分别作1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000稀释，进行方阵染色观察，确定最佳工作浓度。?
1．5．4 特异性试验 用上述感染DHV R85952?株肝脏切片作为阳性抗原，并设DHV阴性雏鸭肝脏切片作阴性对照，以生理盐水、正常BALB/C小鼠血清代替鼠抗DHV阳性血清，酶标抗体为二抗，进行免疫酶组化染色。?
1．5．5 阻断性试验 以1 000、2 000、4 000、8 000 EID50?/ml的DHV A66?
株尿囊液和不含病毒的正常鸡胚尿囊液分别与工作浓度的高免血清等量混合，37℃作用1h后替代工作浓度的高免血清作为一抗，与阳性肝脏切片进行组化染色。?
1．6 试验感染雏鸭组织中DHV的检测 300只3日龄雏鸭随机分成2组，对照组60只，试验组240只，分别隔离饲养。试验组每只皮下注射病毒上清液0.2 ml，观察和记录攻毒后临床表现和死亡情况。于攻毒后6 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h分别扑杀6只试验组和3只对照组雏鸭，取其肝、脾、脑、心、肺、肾、胰、小肠等组织块，置10%中性福尔马林中固定制成石蜡切片，检测DHV。?
2 结果
2．1 高免血清和酶标抗体工作浓度的确定 方阵染色的结果详见表1。由试验结果确定高免血清和酶标抗体的最佳工作浓度分别为1∶64和1∶400。
表1 高免血清和酶标抗体最佳工作浓度的确定(略)?
2．2 特异性试验结果 DHV R85952?株肝脏切片呈现阳性染色，而以生理盐水、正常BALB/C小鼠血清代替鼠抗DHV阳性血清、DHV阴性雏鸭肝脏切片等各张切片染色均为阴性，表明建立的免疫酶组化技术具有良好的特异性。?
2．3 阻断性试验结果 以1 000、2 000 EID50?/ml的病毒量不能阻断染色反应，但染色强度减弱，而4 000、8 000 EID50?/ml的病毒量完全阻断了染色反应，正常鸡胚尿囊液则呈现强阳性。?
2．4 试验感染雏鸭组织器官中DHV检测结果 对不同感染时间雏鸭器官组织切片酶染观察发现，感染后6h在肝细胞的胞浆内出现了棕黄色反应物，部分肾脏、小肠和脾脏切片的细胞浆开始检测到棕黄色反应物。12～16 h，肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、小肠切片均能检测到棕黄色反应物。至24 h，心肌和脑组织细胞均能检测到棕黄色反应物。随着时间的延长，所有组织阳性细胞数量逐渐增多，胞浆内反应物加深呈棕色。检测结果见表2。
表2 试验感染雏鸭各组织器官中DHV抗原动态检测结果(略)
3 讨论 ?
3.1 在组织抗原定位的检测中，一般多应用免疫荧光抗体技术和免疫酶组化技术，但由于免疫酶组化技术的敏感性和特异性不仅可与荧光技术相媲美，而且所获的结果可以长久保存，在普通光学显微镜下即可观察，应用范围更广。所以本研究以鼠源抗DHV高免血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了间接过氧化物酶组化法检测石蜡切片中DHV的技术，经过特异性试验和阻断性试验表明该方法具有良好的特异性，特别是通过Harris苏木素衬染组织后，不仅对DHV在组织中可以精确定位，而且可以同时观察组织病理学变化，因此，本研究建立的免疫酶组化技术尤其适合鸭病毒性肝炎的病毒抗原定位和动态分布以及发病机理的研究。?
3.2 从试验感染雏鸭各组织器官中DHV抗原动态检测结果可以看出，DHV侵入雏鸭机体后最先在肝细胞检测到，其后是从肾脏、肺脏、脾脏、小肠、胰脏等组织细胞中检测出，最后是从心肌和脑组织细胞中检测到DHV，这一结果与所报道的免疫荧光测定、运用组织匀浆结合病毒滴度测定及应用单克隆抗体PAP法测定结果一致而与汪铭书等所报告的DHV强毒在雏鸭体内Dot-ELISA检测到的顺序不完全一致。试验结果表明，DHV定位的首选靶器官应当是肝脏，其次是脾脏、肾脏、肺脏和肠，所以DHV主要是通过粪便排泄到体外，而且感染途径可能主要是经口感染。至于DHV在脑组织中较晚检测到可能是由于受到血脑屏障的作用，一旦病毒突破了血脑屏障到达脑组织后引起脑细胞病变，但雏鸭出现以角弓反张为主的神经症状后不久死亡，是否有理由认为DHV强毒对雏鸭有致病能力是因为病毒能进入雏鸭脑组织，有待进一步研究证实。另一方面我们认为DHV引起雏鸭急性肝炎导致肝功能衰竭（肝昏迷），是引起感染雏鸭发病和死亡的一个重要原因。
