蛋白酶和淀粉酶活性检测方法探讨

     随着酶制剂在养殖业中应用日益增多，产品质量也参差不齐，市场上时有低劣酶制剂出现，而酶制剂酶活的测定比较繁琐，有关酶活的定义、测定方法、测定条件尚不统一，给广大用户在选购和使用时造成很多不便，难免上当受骗造成不必要的经济损失。本文就蛋白酶(中性蛋白酶和酸性蛋白酶)和淀粉酶活力简便、快速测定方法简介如下:

    1 蛋白酶活力的测定

    1.1 原理

    采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

    1.2 试剂

    1.2.l 福林-酚试剂

    向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

    1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

    1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液 精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

    1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液

    精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

    1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液

    1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液

    精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。

    1.2.5.2 测试中性蛋白酶缓冲液 精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L

    Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L

    Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。

    1.2.6 100μg/mL酪氨酸溶液

    精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。

    1.3 操作步骤

    1.3.1 酪氨酸标准曲线的绘制

    取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色创定(波长66Onm)，以浓度为Oμg/mL酪氨酸反位液做空白对照。

    ’ 1.3.2 样品酶活的测定

    精确称取酶粉5g，充分碾细,加去离子水100mL，在40℃水浴中搅拌30min，充分溶出酶蛋白，然后过滤，留滤液待测。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L

    TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH

    7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温1Omin后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温2Omin，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5nL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长66Onm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。

    管号 标准酪氨酸 去离子水 Na2CO3 福林一酚试剂 酪氨酸含量

    (100μg/mL)(mL) (mL) (0.4mol/L)(mL) (mL) (μg/mL)

    1 0 1.0 5 1 0

    2 0.2 0.8 5 1 20

    3 0.4 0.6 5 1 40

    4 0.6 0.4 5 1 60

    5 0.8 0.2 5 1 80

    6 1.0 0 5 1 100

    1.4 蛋白酶活力计算

    蛋白酶活力，Ax4xN/l0。

    式中:A:对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；4:4机反应液取出1mL；N:酶粉的稀释倍数；10:反应时间1Omin；蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

    

    2 淀粉酶活力的测定

    测定淀粉酶活力的方法有4类，一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和碘-淀粉比色法等；二为生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三为色原底物分解法，四是酶偶联法。其中碘-淀粉比色法测淀粉酶活力操作简便迅速、实用。

    2.1 原理

    碘-淀粉比色法淀粉经α-淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与末被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉的量，推算肘淀粉酶活力。

    2.2 试剂

    2.21 底物缓冲液

    精确称，取9.0g；氯化钠；22。6g无水磷酸二钠和12.5g无水磷酸二氢钾，置于约500mL去离子水中力口热至沸腾溶解。称取0.4g可溶性淀粉于一小烧杯中，加入10mL去离子水，使其混悬后加人上述沸腾溶液中，冷却至室温后加入5mL37%甲醛溶液，用去离子水稀释至1000mL。此即为pH7.0、酶底物淀粉浓度为0.4g/L的缓冲液。

    2.2.2 碘贮存液(0.1mol/L)

    称取1.7835g碘酸钾和22.5g碘化钾，溶于去离子水中，再缓慢加人4.5mL浓盐酸，用去离子水稀释至500mL，充分混匀，贮棕色瓶中，每月配制新鲜溶液，置冰箱中保存。

    2.2.3 碘稀释液(0.lmol/L) 取碘贮备液用去离子水稀释10倍，贮棕色瓶中，现用现配。

    2.3 操作步骤

    称取酶粉1.0g充分碾细，加去离子水100mL,在40℃水中搅拌30min，充分溶出酶蛋白，过滤，滤液备用。按表2分别加入底物缓冲液、酶滤液、碘稀释液和去离子水，混匀，于660nm波长处(lcm光径)，以去离子水调吸光度为零，读各管吸光度。

    表2 试剂用量

    加入物 测定管（Ｕ）（３支平行样）空白管（Ｂ）

    底物缓冲液(40℃预温５min,mL) 1.0 1.0

    酶滤液（mL）混匀，40℃水浴7.5min 0.2 -

    碘稀释液（mL） 1.0 1.0

    去离子水（mL） 6.0 6.2

    2.4 淀粉酶活力计算

    淀粉酶活力= 式中:AB:空白管吸光度；AU:测试管吸光度；淀粉酶活性定义:lmL酶滤液中(1g酶粉)的酶，在40℃和底物淀粉作用30min，水解10mg淀粉为1个淀粉酶活性单位。

    3 讨论

    目前市场上出售的酶制剂种类很多，由于酶的定义和测定方法至今没有统一，不同的生产厂家采用标准和定义往往各不相同，产品质量说明也就缺少科学依据。本文简介了蛋白酶和淀粉酶活性定义和测定方法，供同行共同探讨，以便找出更加科学、合理、统一的简便易行的酶活测定方法，促进酶制剂在饲料工业中的发展。