有机微量元素产品质量的检测方法概述

    有机微量元素是指微量元素的无机盐与有机物及其分解产物形成的化合物。根据美国饲料管理官员协会（AAFCO，2001）关于有机微量元素的定义，有机微量元素化合物可以分成5类：（1）由可溶性金属盐与某种或几种氨基酸形成的金属氨基酸络合物，（2）由可溶性金属盐与一种特定氨基酸形成的金属氨基酸络合物，如赖氨酸铜络合物，（3）由可溶性金属盐与氨基酸按1:1～1:3（最好为1:2）比例以共价键结合而成的金属氨基酸螯合物，（4）由可溶性金属盐与多糖溶液形成的金属多糖络合物，（5）由可溶性金属盐与部分水解的蛋白质螯合而成的金属蛋白盐。

    市场上所销售的有机微量元素产品较多，如美国Zinpro公司和Alltech公司均有各种商品有机微量元素投放市场，国内也有多家企业生产此类产品，但目前仅有测定有机微量元素产品中金属总含量的方法，未考虑金属原子是结合还是游离状态，因此市场情况比较混乱，许多产品作为有机微量元素销售，但其实质不过是微量元素混合物。为了推动有机微量元素产品质量检验的深入研究，从而建立有机微量元素产品的相关标准，用以规范饲用有机微量元素产品的生产、销售和使用，本文对有机微量元素质量定性定量分析方法进行概述。

    1 定性检测方法

    李素芬（2000）较详细地描述了一些检测方法，如分子量法、溶解度法、用红外线和X-衍射测定固体产品中配位基团的偏振程度等的不足之处。早期开发的测定有机微量元素质量的方法包括分子大小、分子量和可溶性方面的方法，但这些方法都缺乏真正的科学依据（全健，1998）。Leach和Patton（1997）指出，单独应用矿物质溶解度不能显示有机微量元素产品潜在的生物可利用性，溶解度主要与配基有关，如赖氨酸铜的溶解度好，蛋氨酸铜的溶解度就很差。

    核磁共振、X-光衍射和红外光谱法可用于检测固体纯品中有无络合态元素存在（Hynes和Kelly，1995），其中X-光衍射分析能提供晶体化合物的丰富的分子结构信息，但由于产品中的稀释剂和载体会严重干扰分析结果，所以X-光衍射只适用于晶体纯品的络合态结构分析。

    Holwerda（2001）介绍了一种新的色度检测法，可以定性地检测有机矿物补充物的“络合”程度，至少可用于铜、锌这两种金属元素。这种“快速检测”虽不能得出定量的结果，但是它的费用便宜，而且在饲料加工厂或现场可以简捷地运用。其原理是氯醌盐（CA，紫色）与金属阳离子结合时，可起到络合剂的作用，游离的含水铜和锌离子与氯醌盐结合时生成绿色的不溶配位聚合物（Bottei和Green，1968）。由于氯醌盐不是一种很强的络合剂（Martell等，2001），充分络合的有机矿物中各种结合的成分将不会被CA2-所置换，故氯醌盐的特征红紫色基本上不发生改变。但是，这种方法是将试样在纯水中溶解后直接加以比较，所以不能得出有关金属在生理条件下的络合率。由于试样并未称重和测定浓度，因此不可能得出有关络合或螯合金属在溶液中所占百分比的定量结论，也不可能只依靠色度来区别简单的络合和螯合。此外，这种快速检测只可用于至少是适度地溶于水中的试样，因为如果没有足够的溶解金属同全部指示剂发生反应，会使络合检测的结果不真实（保持紫色），如对难溶的氧化锌进行快速检测将不能获得有意义的结果。快速检测的局限性还在于背景的颜色，它会使检测的结果和二次反应变得模糊不清，从而使得对色度做出的解释无效。

    滕冰（1999）提出对微量元素氨基酸螯合物商品检验的简单实用方法，即先定性，用甲醇浸提待测螯合物样品，过滤得滤液，滴加双硫腙试剂液，如系纯螯合物或微量元素离子极微，则溶液显绿色。螯合物混有无机盐时，随无机组分加大颜色由绿色向红色过渡。判定确为螯合物后，再做定量分析，确定螯合物的微量元素和氨基酸的种类和数量。因为原子吸收光谱和氨基酸分析仪测定的结果并不能说明螯合金属离子或氨基酸的数量，因此这种方法属于氨基酸螯合物商品检验的定性分析方法。

    2 定量检测方法

    评价有机微量元素产品质量的量化指标包括产品中络合物或螯合物所占的比例及已经络合或螯合部分的稳定程度，即络合率和络合强度。关于络合率检测方法，以前的研究工作中多采用电化学分析方法，如离子选择性电极法、氧化还原电位滴定法、浓差电位法等测定络合体系的络合率。但这类方法有很多不足，一是只能间接笼统地测得游离或络合金属离子的总量，而不能直接得到不同分子量分布的络合物组分；二是方法准确度差。由于电位测定法一般要求样品的浓度较低，所以样品大都经过稀释方能测试，而浓度对络合反应影响很大，溶液稀释后络合平衡会发生移动，所以电化学方法的结果不能代表真实情况；三是方法局限性较大。如离子选择性电极，目前仅限于Cu2+、Ca2+等少数几个离子有选择性电极，且性能不太稳定；电位法测定要求有和组分离子相同的高纯度金属材料，而且必须有很好的氧化还原稳定性，同时电极的制备缺乏标准，人为因素影响较大（张晓鸣，1999）。

    凝胶过滤色谱法可以按分子大小将不同形态微量元素分开，为研究有机微量元素的存在状态提供了一种重要的检测手段（Brown和Zeringue，1994；Matsui等，1996）。Cao（1998，2000）利用凝胶色谱柱检测缓冲液中游离态和络合态锌，结果表明在pH值为2和5的缓冲液中，有机锌产品的洗脱峰与硫酸锌中锌离子的洗脱峰相同，而对于有机锌产品的中性水溶液，在离子态锌的洗脱峰之前还出现一个较小的洗脱峰，说明此条件下小部分锌为络合态。其后，Guo（2001）证实了这种方法检测游离态和络合态铜的有效性，但是此方法不能检测不溶性部分的络合率。Leach（1997）认为，高压液相色谱法（HPLC）及其它分离技术如膜过滤法，常规下无法用于金属络合物。这是由于溶液中的金属络合物，总是处于游离金属与配位体的动态平衡状态。该平衡溶液组分的分离可导致络合物快速分解，这种分解通常比HPLC或过滤分析技术更快，这样就会得出有问题的结果。

    Leach（1997）提出两步法检测铜蛋白盐样品。第一个测定指标是样本中不溶成分百分比，如果配基和金属原子结合，那么样品粉末和滤液的配基和金属原子比率应一致。第二个测定指标是金属——配基的结合键，经过滤后滤液用铜离子选择电极来测定游离铜元素含量，用原子吸收法测出总铜含量，两者之差即为络合铜含量。约定的游离铜含量越高表示杂质含量越高。他指出这种方法虽然是比较简单和浅显的，但是可以很容易地判定铜蛋白盐产品的优劣程度。林萍（2004）用Sephadex G-10凝胶色谱对合成的甘氨酸螯合铁的组成进行了初步分析，结果发现：游离的氨基酸用硼酸洗脱液洗脱7min就出峰，而甘氨酸螯合铁样品用硼酸洗脱液洗脱60min仍无吸收峰，由此说明，在甘氨酸螯合铁中没有游离的甘氨酸存在，螯合铁在溶液中可能是以阴离子的形式存在，和葡聚糖凝胶之间存在静电作用。通过测定游离配位体含量检测有机微量元素络合物的方法，尚有待进一步试验研究。

    极谱法是利用电化学技术来测定络合物络合强度的一种方法，其基本原理是根据金属元素与配位体形成络合物后, 在电压作用下还原为锰汞齐的难度加大,电位向更负的方向移动。因此，根据络合物与锰离子还原为Mn(Hg)的E1/2差值，即可计算络合物的络合强度（Qf），其值随着络合物稳定常数的大小而变化，而稳定常数是络合物的一种重要特征常数，它可以定量地度量络合剂与金属离子间亲和力的大小，所以络合强度可以反映溶液中所有络合物组分的平均稳定性。Skoog和West（1963）曾利用滴汞电极测定了有无螯合配位体存在时金属离子的电位变化。Holwerda等（1995） 和Holwerda（1997）将这种方法应用于矿物元素蛋白盐络合强度的测定，并提出金属络合物络合强度的划分方法，即络合强度低于10的为弱络合强度，介于10～100之间的为中等络合强度，介于100~1000之间的为强络合强度，超过1000的为极强络合强度。但此方法只可用于测定饱和溶液中有机微量元素的络合强度，且不能得出游离态和络合态元素的比例。

    为了研究锰在生物体内的作用机制，人们对生物样品（如肠液、粘膜细胞液和血液）中不同形态锰的检测也进行了初步探索。David等（1982）用电子顺磁共振（PER）测定，大鼠肝细胞内总Mn（Ⅱ）为35nmol/ml细胞液，其中游离Mn（Ⅱ）为0.7nmol/ml细胞液，其测定原理是由于存在未成对电子，大多数氧化态的锰具有顺磁性，在磁共振谱图上出现六重超精细谱，而被络合的锰（Ⅱ）却没有。络合锰的这种性质可用于研究酶—金属离子—底物（E—M—S）体系，在这样的生物体系中，配合物中的金属离子不具有顺磁性。能否根据游离锰和络合锰顺磁性的不同，将此项复杂而精细的分析技术用于有机微量元素产品中络合态元素的定量分析，避免破坏游离态和络合态元素之间的动态平衡，还有待于进一步试验研究。

    3 问题思考

    由于络合物化学的复杂性，鉴别有机微量元素产品质量仍然是充满挑战的复杂过程。目前所报道的检测技术各有局限性，生产者可根据有机微量元素产品的种类和所具备的试验条件来选择相应的检测方法，但提出有机微量元素产品质检的标准方法仍将有赖于分析鉴定新技术的深入应用和跨专业的合作研究。

    有机微量元素产品的质量控制，主要是为了反映该产品是否真的适于动物营养的要求，即其在养殖生产上的应用效果。很明显，有机微量元素产品的生物利用率受其稳定性的影响很大，如果稳定常数过低，在消化道环境中易分解而失去了有机微量元素的优越性；如果稳定常数过高，当机体需要时不能及时释放金属元素，造成有机微量元素不能被有效利用。Li等（2004）的研究表明，肉仔鸡对中等络合强度有机锰源的相对生物学利用率明显最高，弱和强络合强度的有机锰源的相对生物学利用率有高于无机硫酸锰的趋势，说明有机锰源的络合强度与其对肉仔鸡的相对生物学利用率之间有密切相关性。但目前有关有机微量元素的稳定性与其利用率关系的研究还比较少，能否根据络合强度指标预测有机微量元素产品的生物有效性，尚需开展不同种类有机微量元素产品的动物试验进行验证。

    综上所述，无论是饲料工业管理部门，还是饲料生产企业，或是广大养殖业用户，都急需一套饲用有机微量元素的产品质量标准和分析检验及鉴定方法，这些技术难题的攻克尚需技术监督和饲料管理部门以及科技工作者共同努力。

    浙江建德维丰饲料有限公司/洪作鹏

    原刊于《新饲料》杂志2006年第10期