反刍动物消化营养研究中的指示剂

     在反刍动物消化营养研究中，很难利用全部收集营养物质的方法来测定养分的消化率或某段消化道内食糜的流通量。而应用指示剂与消化前后营养物质间比例关系的变化，可以计算出所需要的试验数据。在反刍动物消化营养研究中应用的指示剂，一般分为内源指示剂和外源指示剂。但不论哪一种，作为理想的指示剂都应该符合以下条件：1）无任何毒副作用；2）在动物胃肠道中绝对不能被消化和吸收；3）不结块，与食糜混合均匀，并保持其分布不变；4）对胃肠道的分泌、消化、吸收等正常生理功能和微生物区系无影响；5）从物理特性来看，与所标记的物质很接近或者是紧密结合在一起的；6）食糜样本内标记物的分析方法，必须特异性强、非常灵敏而又简单易行。现在所通用的指示剂，还没有一种能够完全符合上述条件。尽管如此，一些标记物仍然被广泛地应用在消化率、消化道不同食糜的分配和滞留时间等项目的测定上。 1 内源指示剂 1．1 木质素 人们通常认为饲料中的木质素是不能被消化的，因此把木质素作为内源性指示剂广泛地应用于消化研究中。但从过去的研究结果来看，应用木质素作为指示剂在木质素的测定上存在很大问题，并且木质素不能完全从粪中回收。Fahey和Jung（1983）认为，木质素在通过胃肠道时有一部分被降解或其结构被改变，从而导致粪中的回收率低。大量的研究报道证实，在消化过程中部分木质素消失，其表观消失率为8％～53％，并且大部分消失的木质素发生在瘤胃。通过消化道时物质的丢失，是严重违背作为指示剂的标准的。因此选用木质素作为指示剂应慎重。木质素或其他指示剂的不完全回收，会低估消化率，随着丢失程度的加大或日粮中木质素含量的降低其误差加大。另外木质素的化学性质尚未完全弄清，缺乏准确的化学定义，用之作为指示剂缺乏可靠性。同时对木质素的分析技术也存在很大的经验性，导致对本质素含量的估测显著不同。Muntifering（1982）证实，木质素测定技术（如：ADL、KMn04木质素或ABSL）的选择，显著影响木质素的回收，从而影响对粪中木质素和在食糜中流通量的测定。 1．2 Si02 100多年前，SiO2首先被估定为不可消化，并推荐用做指示剂。许多研究表明，Si02在粪中的回收率普遍过高，特别是放牧、简易舍饲或围栏饲养的家畜更是如此。这可能是由于动物采食时，饲料被尘土污染或直接食入了土壤，从而摄入了其中的SiO2所造成的。另外SiO2也明显地被吸收并从尿中排出影响测定。目前很少采用SiO2作指示剂测定消化率。 1.3 AIA饲料中的灰分在沸HCl中是不溶的，不被动物吸收。粪中的AIA含量昼夜变化很小，分析技术准确，因此AIA是一种可靠的指示剂。在猪、禽的研究中，用灰分作为消化率指示剂所获得的结果与全收粪法获得的结果同样准确。用绵羊进行消化试验表明（van Keulen和Young，1977），灰分几乎可以完全从粪中回收，并且估测的消化率与传统方法获得的数据没有显著差异。与其他指示剂一样，用AIA作为指示剂测定消化率的准确性，取决于对该物质摄入量的准确测定。这对于舍饲动物没有问题，但应用于自由放牧家畜时，也存在与SiO2同样的问题（饲料被尘土污染或直接摄入土壤）。另外当饲料中AIA浓度很低时，如谷物或苜蓿日粮，饲料中AIA绝对含量的分析误差，会影响AIA作为指示剂的准确性。 2 外源性指示剂 2．1 色染饲料 利用酸性品红、洋红、亮绿或亮蓝、龙胆紫和卡红等染料对饲料颗粒进行染色处理。染料是首先应用的颗粒饲料指示剂，早期主要用于食糜滞留时间的测定。色染饲料颗粒作为指示剂具有一定的优点，它可以对通过肠道的特定食糜颗粒进行认证，并且可以对一个混合日粮中的不同饲料，采用不同的染料进行处理。但对色染饲料作定量分析的方法不尽如人意。色染颗粒的分析必须用视觉检测，计算样本内色染颗粒的数量，工作量大且存在人为误差。色染饲料不能用于消化率的测定，另外由于对色染饲料分析的半定量性，通过色染饲料测定的食糜滞留时间应视作相对值而不是绝对值。 2.2 Cr203 很多不溶性的金属氧化物已作为指示剂应用于营养学研究中,其中最常用的是Cr2O3，作为单标记物测定消化率和食糜流通量，其应用要比其他指示剂广泛得多。许多研究表明，作为指示剂Cr2O3具有很多优点，可以在粪中完全回收，并且有很多可靠的分析方法。Cr2o3是一种致密的粉末，悬浮在食糜中以一个独立于固相食糜和液相食糜的速率通过消化道。因此在测定食糜滞留时间时，不宜选用Cr2o3作为指示剂。Cr2O3在瘤网胃也可能形成沉淀物，并断续通过胃肠道，以致粪中Cr2O3的分布，常受昼夜变化的影响。然而只要考虑到这些变化，并通过采用适当的Cr2O3投放方法和粪便与食糜的采样方法，以消除其影响，作为指示剂测定消化率和瘤胃后食糜的流通量，Cr2O3还是有其可取之处的。 Cr2O3经常被用来校正通过桥型瘘管24h获得的动物食糜流通量。但对装有简单T型瘘管的动物，点状采样作为指示剂测定流通速率时，有人曾提出质疑。因为在消化道内许多部位食糜的颗粒部分和液相部分的流通速度不同，在食糜采样过程中食糜的固液相极易分离，所以由T型瘘管所采集的食糜，样本很难真正代表食糜的实际情况。一些报道认为，用Cr2O3或任何单标记物想准确测定装有简单瘘管动物瘤胃后消化道食糜的流通量，都是不合适的。鉴于此，Faichney（1975，1980）和Ellis（1982）建议采用双标记物来测定较为合适，如采用Ru－phen或稀土元素Cr-EDTA作为固液相的标记物测定食糜流通量。因为双标记物测定法可以通过重组校正而取得食糜内标记物的真正代表性浓度。Faichney（1972）对比了单标记物Cr2O3与双标记物的测定结果，认为Cr2o3会低估食糜流通量。而有些学者认为，在测定消化道内食糜流通量时，单、双标记物测定的结果对比在统计分析上没有显著差异（McAllan等，1983；莫放等，1992）。也有其他研究证明，无论是简单瘘管还是桥型瘘管，以Cr2O3作为指示剂，点状采样所获得的食糜流通量，与从桥型瘘管全排空法收集所测得的数值一致。 2.3 稀土元素 镧（La）、钐（Sm）、铈（Ce）、锖（Yb）、镝（Dy）等稀土元素已作为指示剂应用于反刍动物消化率和流通率的研究。稀土元素可定量地从消化道排泄，其检测方法敏感。很小浓度的稀土元素，显示出很强的吸附特性。饲料中稀土元素的应用表明，稀土元素被饲料颗粒紧密地粘合在一起，消化期间标记的和未标记饲料间的迁移很小。因此稀土元素似乎不仅可以作为固相食糜可靠的标记物，也可以作为日粮内特定饲料颗粒的标记物。但以后又有研究表明，稀土元素在食糜颗粒间的迁移可能是相当大的，而且受很多因素影响，如稀土元素应用的方法、对单个饲料的粘合能力和亲和力、标记食糜颗粒的消化程度等。标记食糜在通过消化道时，理化条件的改变，特别是真胃中的酸性pH值，会增强稀土元素的迁移和溶解，另外瘤胃细菌也可能造成稀土元素在瘤胃内的滞留（Combs等，1984），这些发现使人们认为稀土元素不适于作为颗粒食糜的标记物。不同稀土元素与颗粒食糜的粘合程度可能是不同的，因此应用这些稀土元素来获得的食糜流通率和食糜滞留时间的可靠程度，取决于针对研究日粮应用的研究方法。另外应该清楚所获得数据的前提假设，即在真胃或十二指肠近端的酸性食糜样本中，假定稀土元素是始终与颗粒食糜是粘合在一起的。 2．4 Ru＿phen, Ru一phen作为指示剂的很多优点与稀土元素相类似。Ru-phen与颗粒物质具有很强的结合能力，可在粪中定量检测，同时具有可靠的分析技术。但在消化和通过消化道时，Ru－phen也发生一定程度的迁移和游离。瘤胃细菌也可能在标记Ru－phen饲料的转运过程中，充当载体的角色。 2．5 铬标记纤维 通过特定的媒染过程，铬（Cr）与植物细胞壁间形成很强的复合物。当媒染物中Cr含量超过8％时，这种复合物在瘤胃液和酸性介质中有良好的稳定性，并且基本不被消化。这种复合物是目前所应用的颗粒相标记物中最独特的一种。以Cr标记纤维为指示剂，测定消化率和食糜流通率可获得可靠的数据。但Cr媒染物应用的最大缺陷，就是准备期间要求严格的化学处理以使媒染颗粒不被消化。由于标记物在食道中运动的不同，应用Cr标记纤维测定颗粒食糜的滞留时间，可能反映的是滞留时间相对值，而不是绝对值。另外媒染物中的Cr浓度，影响物质的密度，当Cr浓度增加时，密度同样增加，对于饲喂相同日粮的动物，其瘤胃周转率的测量值也增加。尽管存在这些问题，但由于Cr标记纤维能对特定食糜颗粒进行标记，同时比较容易测定，因此Cr标记纤维是一种极具潜力的标记物。 2．6 水溶性标记物 聚乙二醇（PEC）易溶于水，几乎可完全在粪中回收。PEC作为指示剂已在反刍动物研究中应用多年。但是PEG的分析技术不够准确，尽管许多人已经通过放射性同位素（l4C、3H）标记PEG以增加测定的准确性，还是不尽如人意。另外PEG可能吸附一定的日粮成分,或者由于单宁的存在而被沉降。在反刍动物研究中作为液相标记物，Cr-EDTA和Co一EDTA已相继代替了PEC。与PEC相同，Cr-EDTA和Co-EDTA也易溶于水。现已广泛应用于瘤胃液相体积和稀释率的测定。与PEC相比，其分析方法简单，并且非常准确。在瘤胃中少量的Cr-EDTA和Co－EDTA可能与颗粒食糜相结合，一部分复合物（＜5％）被吸收，并从尿中排出。在大多数情况下，与测定结果相比，其误差是微不足道的。 3 小结 总之，不同陶指示剂具有不同的特性，因此我们应当根据不同的检测目的，选择适当的指示剂，并采用适当的投饲方法（如：一次性灌注法和连续灌注法）和采样规程，以期获得相对可靠的数据。