甲醛处理日粮小麦蛋白对湖羊消化代谢及内分泌的影响_饲料资源_科技

本研究的目的在于对小麦中的蛋白质进行甲醛保护，使它们在瘤胃中免遭微生物过度降解，以便在胃蛋白酶的作用下释放出阿片活性肽，从而进一步调节反刍动物的消化代谢和内分泌，为提高小麦的饲料利用率提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料3 头装有永久性瘤胃和十二指肠瘘管的成年、空怀、健康的母湖羊。试验按自身对照设计，分I 期（对照期）和II 期（试验期）。每期为时8 d，各期之前都有7 d 的适应期。2 期均为自由采食干稻草并定量添加精饲料。精饲料配方为：豆饼100 g/kg（10 %），小麦885 g/kg（88.5 %），尿素5 g/kg（0.5 %），磷酸氢钙10 g/kg（1 %）；试验期精饲料中的小麦550 g/kg （55 %）经甲醛处理（0.6g 甲醛/kg 小麦）（Yao 等，1992）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集和处理。于每期试验的第4、6、8天采集瘤胃液和十二指肠食糜，时间为4∶00，8∶00，12∶00，16∶00，20∶00，24∶00。采后立即- 20 ℃冻存。于试验期的第8 天，由临时性静脉血管插管采集血样，时间为12∶30 ～15∶30 每15 min 采样1次，血样经抗凝预处理，离心获得血浆。
1.2.2 测定指标及方法。挥发性脂肪酸（VFA）用气相色谱法测定。十二指肠食糜流量用EDTA- Cr标记法测定（铬离子以原子光谱法测定）。氨氮以靛蓝染色法测定。中性洗涤纤维（ADF）用VanSoest 的酸性洗涤法测定。血浆胰岛素用放射免疫法测定。日粮和食糜总氮用凯氏定氮法测定。将每头羊每天5 个时间点的十二指肠食糜样品等量混合成一个样品，12000 r/min 离心5 min，取上清液，并利用NG108- 15 细胞测定上清液中的阿片样物质活性。其原理为：神经胶质瘤细胞NG108-15 内的腺苷酸环化酶活性受细胞表面的阿片受体调节，阿片样物质可抑制该酶活性，而纳洛酮（一种阿片受体拮抗剂）可消除阿片样物质对该酶
活性的抑制。从而可以通过有或无纳洛酮，NG108- 15 细胞内cAMP 浓度的差别，即对腺苷酸环化酶的抑制程度来确定溶液中的阿片样物质活性（Brantl 等，1979；Sharma 等，1975）。具体操作步骤为：将1640 细胞培养基、十二指肠食糜上清液、无菌水（或1mmol/L 纳洛酮）按1∶0.8∶0.2 的比例进行混匀。将贴壁良好的NG108- 15 培养基倾去，加入前述混合液共同孵育15 min 后，加入三氯醋酸中止反应。然后吹散细胞，4000 r/min 离心收集细胞，清洗后破碎细胞，12000 r/min 离心，取上清液，分别取部分上清液进行蛋白质浓度及cAMP 浓度测定（Zhang 等，1999）。cAMP 的量以放射免疫法进行测定，以每毫克细胞蛋白质所对应的cAMP 量来表示细胞内cAMP 的含量，单位为：pmol/mg。cAMP 放射免疫法测定试剂盒由上海中医药大学同位素室提供，胰岛素放射免疫法测定试剂盒由上海生物制品厂提供。本试验中阿片样物质总生物活性以腺苷酸环化酶的抑制程度来表示，其计算方法为：腺苷酸环化酶的抑制率（%）=（有纳洛酮时－无纳洛酮时）/有纳洛酮时×100。
1.3 数据处理所有数据均以X±SE 表示。用t检验法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 采食量的变化由表1 可见，试验期湖羊的粗饲料采食量比对照期增加7.99 %（P < 0.05）。
其中ADF 的摄入量上升7.02 %（P < 0.05），总氮摄入量上升2.71 %（P < 0.05）。
2.2 瘤胃消化代谢的变化由表2 可见，试验期瘤胃液总挥发性脂肪酸（TVFA）水平与对照期相比无显著变化、瘤胃液NH3- N 水平略有上升。
2.3 十二指肠区消化代谢的变化见表3。与对照期相比，试验期湖羊十二指肠食糜日流量平均下降5.16 %，但差异不显著；总氮日流量上升18.86 %（P < 0.01）、NH3- N 日流量略有上升、非氨氮（NAN）日流量上升20.16 %（P < 0.01）、过瘤胃蛋白（BPN）上升38.70 %（P < 0.01）；ADF 复胃消化率平均提高8.79 %（P < 0.01）。此结果表明，进入十二指肠的总氮量上升，尤其是过瘤胃蛋白上升极显著；ADF 复胃消化率极显著提高。2.4 十二指肠食糜中阿片样物质总活性的变化见表4。当在NG108- 15 细胞培养基中加入十二指肠食糜上清液时，试验期的NG108- 15 细胞内cAMP 水平比对照期低58.87 %（P < 0.01）。而在NG108- 15 细胞的培养基中同时加入十二指肠上清液和纳洛酮溶液时，试验期的细胞内cAMP 水平与对照期相比无显著差异。由表4 可见，与对照期相比，试验期十二指肠食糜上清液对NG108-15 细胞内腺苷酸环化酶的抑制增强了72.30 %（P< 0.01）。
2.5 试验期湖羊血浆胰岛素水平的变化试验期湖羊血浆胰岛素水平上升104.91 %（P <0.05），对照期16.30 ±6.99 μU/mL；试验期33.40±15.26 μU/mL。
3 讨论
以前对反刍动物日粮中蛋白质进行保护的研究，大多是针对增加过瘤胃蛋白含量。本试验发现，日粮中的小麦经保护性处理可提高湖羊的粗饲料采食量、提高ADF 的复胃消化率，增加过瘤胃蛋白量，提高湖羊的血浆胰岛素的同时，湖羊十二指肠食糜中阿片样物质的总活性也增强。研究表明，谷蛋白等食物蛋白不仅在体外经胃蛋白酶g/d水解，能产生具有阿片活性的肽类，在体内消化时也可产生阿片活性物质（Schusdziarra 等，1981）。食物源阿片活性肽不仅能够对胃肠道消化液的分泌起调节作用（Trompette 等，2003），而且会影响动物体的内分泌调节（Schusdziarra 等，1981）。这与本试验结果一致。利用甲醛保护反刍动物日粮中的小麦蛋白质，不仅过瘤胃的小麦谷蛋白增加，这些小麦谷蛋白在胃蛋白酶的作用下可能会释放出阿片活性肽，从而使十二指肠食糜中阿片样物质的总活性增强，进而改善湖羊的复胃消化代谢和内分泌机能。由于小麦中的蛋白质在消化酶作用下，会产生多种阿片活性肽（Fukudome 等，1997；Fukudome 和Yoshikawa，1993、1992），而且反刍动物消化道中也会产生内源性阿片活性肽，因此我们仅测定了皱胃食糜中阿片样物质总的生物活性。关于小麦中的蛋白质在湖羊消化道中形成阿片活性肽的种类与数量，以及形成的阿片活性肽对反刍动物的消化和内分泌的调节机理有待进一步的研究。目前，随着农业科技的不断发展，小麦的产量不断提高，国内有一定份额的小麦已成为或必将成为反刍家畜饲料。由于传统的饲料加工方法，使这一部分小麦的饲料报酬过低，从而影响了相关的种植业和养殖业的积极性，本研究的结果对解决上述问题提供了新思路。

表1 粗饲料采食量的变化（n = 3）g/d

期别	粗饲料	总氮量ADF	总量
I	694.20±39.56	14.41±0.28	401.71±20.13
II	749.67±40.51*	14.80±0.29*	429.92±20.84*

?     注：同列数据肩标* 表示差异显著（P < 0.05）；** 表示差异极显著（P < 0.01），下同。

     表2 瘤胃消化代谢的变化

期别	挥发性脂肪酸（mmol/100 mL）				NH3- N （mg/100 mL）
期别	TVFA	乙酸	丙酸	丁酸	NH3- N （mg/100 mL）
I	5.56±1.10	54.62±6.55	23.75±4.69	21.71±3.18	11.64±1.25
II	5.23±0.85	57.11±7.37	23.55±5.31	19.52±5.04	12.62±1.73

表3 十二指肠氮流量和复胃ADF 消化率的变化

期别	十二指肠氮流量（g/d）				ADF 消化率（%）
期别	总氮	氨氮	非氨氮	过瘤胃蛋白	ADF 消化率（%）
I	9.44±0.51	0.75±0.08	8.59 ±0.48	4.85 ±0.60	55.62±1.33
II	11.22±0.64**	0.77±0.21	10.74±0.68**	6.73±0.76**	64.41±1.00**

表4 NG108- 15 细胞内cAMP 含量的变化（n=9）

期别	无纳洛酮	有纳洛酮	腺苷酸环化酶的抑制率（%）
I	15.00±2.51	26.45±6.39	43.29±13.28
II	6.17±2.03**	24.28±7.75	74.59±16.54**