利用植物乳杆菌N3发酵断奶仔猪料的条件优化

    由于发酵断奶仔猪料具有适口性好、易消化吸收等优良特点，同时能给断奶仔猪提供一定的乳酸和有益菌，抑制了有害菌的生长繁殖，具有促进断奶仔猪生长、缓解断奶应激和提高抗病力等特性，所以具有重要的应用价值。根据目前猪场的实际生产条件以及断奶仔猪料一般都含有较为丰富的乳糖，可以作为植物乳杆菌N3发酵的优良培养基，所以本研究主要对植物乳杆菌N3发酵断奶仔猪料的发酵条件进行优化，为植物乳杆菌N3进一步在断奶仔猪料中的应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
    菌种来源：植物乳杆菌N3由广西大学动科院动物营养教研室提供。
    主要培养基[1] ：植物乳杆菌N3培养基（5号培养基）、发酵培养基（断奶仔猪料）。
    主要试剂：乳酸（AR）、乙酸（AR）。
    主要仪器设备：高效液相色谱仪(WF2800-D3A，德国)、电位滴定仪(ZD-2型，上海洪纪仪器设备有限公司)、微型发酵瓶（罐头瓶）。
1.2 方法
1.2.1 植物乳杆菌N3发酵断奶仔猪料的最佳发酵条件的选择[2]
    采用正交试验确定植物乳杆菌N3发酵断奶仔猪料的最佳条件。试验设计为5因素4水平的正交试验。试验因素有发酵时间、接种量、发酵温度、pH值及湿度，每个处理设3个重复，选用正交表L16（45）来安排试验[2] 。所测试的因素水平见表1。

1.2.2 发酵饲料组成及发酵方法
    发酵培养基采用自配断奶仔猪料，不含任何抗生素，也不含高铜、高锌，参照NRC（1998）猪饲养标准配制[3]，配方饲料组成和营养成分见表2。取自配的断奶仔猪料，每个样品50g，每个处理3个重复，于相应的培养条件下发酵，在相应的时间里取样，测定相关指标。

1.2.3 不同发酵条件下理化指标的测定
1.2.3.1 乳酸、乙酸产量及产率的测定[3,4]
    样品处理：取鲜样10g，用0.05M H2SO4溶液100ml浸提1min，经4层纱布过滤，3 000r/min离心后，在-20℃下保存，以备乳酸、乙酸含量的检测。
乳酸、乙酸含量测定：将处理好的样品解冻后，用分析纯乳酸、乙酸作标准样，用高效液相色谱仪进行测定。根据保留时间，峰面积，标准样乳酸、乙酸的含量计算出乳酸、乙酸的产量。
    乳酸产率测定：根据乳酸的产量（ml/100ml）和饲料湿度，换算出每克饲料发酵后的乳酸产率，计算公式为：
    乳酸产率（%）=乳酸产量/（100%-饲料湿度）。
1.2.3.2 样品pH值的测定[3]
    取鲜样10g，用100ml蒸馏水浸提1～2min后，经4层纱布过滤，水浸液当即用电位滴定仪测定pH值。
1.2.4 筛选适合生产应用的发酵条件
    根据正交试验筛选的最佳组合以及生产实际情况，再进行一次筛选试验，测定指标为乳酸产率。
2 结果与讨论
2.1 正交试验对发酵条件优化的结果
2.1.1 考察发酵时间、接种量、发酵温度、pH值及湿度对有机酸（乙酸、乳酸等）产量的影响，抽取具有代表性的试验号发酵结果进行分析，结果见图1。

    由图1可以看出，发酵产酸主要为乳酸，其它有机酸含量很低，所以分析发酵结果时只对乳酸产率进行分析。
2.1.2 正交试验考察发酵时间、接种量、发酵温度、pH值及湿度5因素4水平对乳酸产率的影响，试验结果见表3。

    从正交试验结果可以分析，5因素对乳酸产率的影响次序依次为：接种量>温度>湿度>时间>pH值，各因素各水平对乳酸产率的影响见表3和图2～图6。
    由极差R值可知，接种量的R值最大，即接种量对乳酸产率的影响最大。由图1、图2可知，从乳酸产率最高来判断，在这4个水平里，最佳接种量为10%。
发酵温度对乳酸产率的影响也较大。由图3可知，从乳酸产率最高来判断，在这4个水平里，最佳发酵温度为37℃。
    发酵湿度对乳酸产率的影响也较大。由图4可知，湿度在45%～65%范围内，乳酸产率呈上升的趋势，当湿度为65%时达到最大值，可以判断4个水平里，最佳发酵湿度为65%。
发酵时间对乳酸产率的影响排在第4位，由图5可知，发酵时间在24～48h范围内，乳酸产率呈上升的趋势，当48h时达最大值，可以判断，在这4个水平里，最佳发酵时间为48h。
由正交试验结果分析可知， pH值对乳酸产率影响最小。由图6可看出，在pH值5.5～6.5范围内，乳酸产率呈上升的趋势，7.0时又有所下降，即在pH值为5.5～7.0范围内，较低pH值不适宜发酵产乳酸，高pH值环境也不适合发酵产乳酸，可能因为较强的酸性环境抑制了植物乳杆菌的繁殖，同时也抑制了它的发酵产酸；中性环境时，培养基中有自然存在的大量微生物相互竞争排斥也不利产酸[5]。故发酵适宜pH值宜选6.5。

    从正交试验结果及对各因素的分析可知，以乳酸产率为判断标准时，最佳发酵条件为：接种量10%、温度37℃、湿度65%、时间48h、pH值 6.5。
2.2 适合生产应用的发酵条件筛选结果
    正交试验筛选的最佳发酵条件并结合实际生产应用，结果为接种量10%、温度37℃、湿度65%、时间48h、pH值 6.5，乳酸产率36.456 3%。在中小型养殖场中应用，为减少生产成本，可以不进行恒温控制和调解pH值，室温和酸碱度中性即可。虽然达不到最好的乳酸产率，但乳酸产率仍可达10.211 7%，可以满足断奶仔猪生长的需要[6]。
3 小结
    本研究对植物乳杆菌N3发酵断奶仔猪料的发酵条件进行筛选优化，筛选出比较理想的发酵条件为：接种量10%、温度37℃、湿度65%、时间48h、pH值6.5。在养殖场应用，可以采用的发酵条件为：接种量10%、温度为室温、湿度65%、时间48h、pH值7.0。

参考文献
1 周德庆主编.微生物学实验手册[M].上海科学技术出版社，1983
2 贵州农学院主编.生物统计附试验设计[M].农业出版社出版，1980
3 李德发主编.中国饲料大全[M].中国农业出版社，2001
4 那淑敏，贾士芳，陈秀珠，等.嗜酸乳杆菌发酵代谢产物分析[J].中国微生态学杂志，1999，11（5）：266～268
5 ERIC GIRAUD,ALAIN CHAMPAILLER,MAURICE RAIMBAULT. Degredation of Raw Starch by a Wild Amylolytic Strain of Lactobacillus plant-arum.Applied and Environmental Microbiology,1994,12(60):4 319～4 323
6 王若军译.养猪科学新概念（第一卷）[M].中国农业大学出版社，2000