弧菌是海洋水环境微生态系的成员,在海水和海洋生物中广泛存在。病原性弧菌能引起养殖生物流行病的暴发,并导致养殖生物的死亡。而鳗弧菌则是其中一种非常重要的弧菌性病原,能够引起养殖鱼类等的皮肤溃烂、肌体出血和死亡,对水产动物的养殖和产业的持续健康发展有着巨大的危害。
据了解,对致病性鳗弧菌和病原性鳗弧菌的检测方法,目前主要有生理生化鉴定技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验和16srRNA基因探针杂交技术。但生理生化检测技术十分耗时耗力,并且结果不稳定;荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备;酶联免疫吸附实验敏感性不高,还易受干扰因素的影响;16srRNA基因在生物物种中非常保守,基因探针杂交技术特异性不强。而PCR则是一种敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法,即使样品中含有少量的细菌也能够检测出;这两种方法的提出标志着我国水产动物疾病的快速检测技术取得重大突破。
据专家介绍,“致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法”和“鳗弧菌的PCR检测方法”可广泛应用于养殖动物遭受鳗弧菌感染情况的检测、监测养殖水体环境中的鳗弧菌和监测鲜活饵料是否遭受鳗弧菌污染,具有广阔的应用前景。
“致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法”在设计特异引物并成功建立致病性鳗弧菌的多重PCR检测技术的基础上,进一步研制成PCR检测试剂盒,其突出特点是建立了多重PCR反应,可快速、准确地检测出样品中的致病性鳗弧菌,为水产养殖动物的疾病诊断提供简单快速准确的检测方法。与其他的弧菌病原检测技术和其他的病原检测技术相比,该方法具有显著特点:一是检测十分快速,3~6小时即可得知检测结果,而其它方法则至少需要24小时或一个星期以上;二是检测灵敏度极高,检测下限降低至10~100个左右的细菌,而现有技术的其他方法必须经过一定时间的纯培养增殖达到100000个细菌后才能进行检测。该发明的主要内容包括由缓冲试剂A、细胞裂解试剂B和C、PCR试剂管、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚蓝上样缓冲溶液组成的PCR检测试剂盒以及一套检测操作程序。
“鳗弧菌的PCR检测方法”是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法,主要包括由样品处理试剂A和B、PCR试剂管、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚蓝上样缓冲溶液组成的PCR检测试剂的配制。在设计特异引物并成功建立鳗弧菌PCR检测技术的基础上,增加了二次PCR处理程序,并在一次PCR反应的基础上,建立二次PCR反应方法,可快速、准确、敏感地检测出样品中的鳗弧菌。与其他的弧菌病原检测技术和其他的病原检测技术相比,该方法具有明显优点和积极效果:一是采用该技术方法检测十分快速,4~8小时即可得知检测结果,而现有其他方法则至少需要1天或一个星期以上;二是采用该技术方法能在一次PCR的基础上进行二次PCR,进一步提高了检测的灵敏度,检测下限降低至1~10个左右的细菌,而现有技术的其他方法必须经过一定时间的纯培养增殖达到105才能进行检测。
这两项技术发明弥补了目前生理生化鉴定技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验和16srRNA基因探针杂交技术等方法在检测时间、稳定性、敏感性等方面存在着的一些缺点和不足,填补了我国水产动物疾病诊断快速检测技术的空白。