1 生物学效价的概念
生物学效价也称“生物学利用率（Bioavailability）”。Sibbald(1987)指出，生物学效价本身是一个抽象的概念，可以给出定义而无法直接测定。这一概念具有多重涵义。张子仪(1994)指出，生物学效价包括消化率、代谢率、同化、有效性和可利用率等多重涵义。一种营养素的生物学效价是指该营养素被动物食入后，被小肠吸收并能参与代谢过程，贮存在动物体内的部分占食入总量的比值，可概括为相对利用率和绝对利用率。
2 饲料矿物质微量元素生物学效价的评定方法
评定饲料矿物质微量元素生物学效价不仅涉及到不同动物、不同生理条件、各种形态的矿物质微量元素的代谢过程，还受控于不同元素之间的互补、拮抗的规律，所以，评定其生物学效价较评定能量、蛋白质生物学效价要困难得多。目前评定矿物质微量元素生物学效价方法有4种，即平衡试验法、参比法、同位素法和细胞生物学的应用法。各种评价方法都有优点和缺点，应根据不同的情况和试验目的选择合适的评定方法。
2.1 平衡试验法
平衡试验法即通过在一定时间内测定动物对元素的食入量和排出量，从而得到被动物吸收或利用的量。Ammerman(1995)将这种评定方法命名为“表观吸收率（apparent absorption）评定法”，即表观吸收率（%）=（某元素摄入量-粪中某元素排出量）/某元素摄入量。 该方法原理简单，所需试验设备也不复杂，因此，在一段时间内该法应用比较广泛。但是，随着研究的深入，该法的缺点也逐渐暴露出来。一方面，此法获得的矿物质元素的吸收率不一定能反映深层次生物学效价。Sealand Heston(1983)报道，2-吡啶羧酸能显著提高大鼠对锌的吸收率（约60%），但同时尿中的锌排出量也随之增加，尽管锌的“表观吸收量”增加了，但锌的净沉积率却没有改变。另一方面，粪是内源性Mn、Fe、Zn和Cu等元素的主要排出渠道。综合以上两方面，用“表观吸收率”来表示某元素的生物学效价具有很大的片面性。虽然可以通过延长试验期、增加动物数量来提高试验的精确性，但需消耗大量的人力、物力和财力。尽管平衡试验评定方法存在很多缺点，但它毕竟是经典的测定表观吸收的方法。使用该方法时，动物处于自然生长状态，其试验结果最接近动物自身状态，对生产实际具有指导意义，是与其它研究方法相比较的参照基准。
2.2 参比法
参比法是一类评定相对生物学利用率的方法，包括斜率比法、三点法、标准曲线法、平均值比法等。参比法原理是基于考察的效应与待评定物和标准物的添加量具有线性关系。通常选用利用率高的物质作为标准物，然后考察标准物和待评定物的添加效应，根据两种物质的效应进行比较，从而求出待评定物相对于标准物的生物学利用率。标准物一般选择利用率高的物质，如评定锌的生物学效价通常采用硫酸锌和氧化锌等；评定锰时采用水合硫酸锰；评定铁时采用硫酸亚铁；评定铜时采用五水硫酸铜。
2.2.1 斜率比法
斜率比法以其灵敏、准确、客观而成为评定微量元素生物利用率最常用的方法。它简单易行，适用于各种元素生物学利用率的测定，且采用多元线性回归法比简单线性回归法更精确，但所测定的结果是相对利用率，需要设定一定的浓度梯度，要求试验动物较多。该法基本原理是假设反映指标（Y）与被测元素在饲粮中的含量（X）呈线性关系（Y=i+bx），当被测物质(at)与标准物质(as)在x=0相交时，即at=as，则bt与bs的比值即为被测物质相对于标准物的生物利用率。多种来源同时进行比较时，多元线性即回归方程中相应化合物的斜率与参比标准物的斜率比，即为该元素源相对于参比标准物的生物学利用率。赵剑(2002)采用斜率比法，以肝脏锌浓度为判定指标，以硫酸锌为参比标准物的研究表明，氨基酸螯合锌的生物学效价为100%。Cao(2000)以羔羊肝脏锌浓度与日粮中锌添加量线性回归的斜率来评定，结果表明，赖氨酸螯合锌的生物学效价为硫酸锌的110%。Hahn(1993)采用斜率比法研究了高水平添加(含锌>1 000mg/kg)下，氧化锌、赖氨酸螯合锌和硫酸锌的生物学效价。以硫酸锌为标准物，以血浆锌为判断指标，氧化锌、赖氨酸螯合锌的相对生物学效价分别为56%、110%。Lewis (1995)用猪研究并测得蛋氨酸螯合铁的相对生物学效价为68%(血红蛋白为判断指标，硫酸亚铁的相对生物学效价为100%)。Cao(1996)以肝脏铁浓度为判断指标，在肉仔鸡的试验研究中表明，蛋氨酸螯合铁的相对生物学效价为88%(硫酸亚铁为100%)。前人对有机锰源生物学利用率的研究，也多采用添加大剂量锰（以骨灰锰含量为指标）来评价有机锰源的生物学利用率。Fly等(1989)以饲料级氧化锰为标准参照物，在不含植酸和纤维的酪蛋白-葡萄糖饲粮中或在上述饲粮中加入10%的玉米-豆粕混合物后的饲粮中添加蛋氨酸锰，结果添加蛋氨酸锰组胫骨灰锰含量均比添加饲料级氧化锰的对照组高30%～74%。但是，不同的研究者因试验背景不尽相同，得到的微量元素的生物学效价差别也很大。可能主要有以下几个原因：①试验所用日粮类型不同；②试验研究持续的时间不同；③试验动物的种属和生长阶段不同；④试验动物体内微量元素贮量背景不同；⑤所选的微量元素产品的种类和质量不同；⑥研究者所选统计处理方法不同；⑦研究中所用评价指标不同；⑧试验设计时所设定的微量元素的添加水平的高低不同。
2.2.2 三点法
三点法是当已知某指标在一定的范围内与被测元素在饲粮中的含量呈线性关系时，取x=0和在此范围内的任意点分别测定参比标准物和待测物的反映量Y，由此作出的两条直线的斜率比来计算被测物质的相对生物学利用率。这种方法设定含量梯度仅为两个，试验简单，但必须有足够的前提条件做保证。
2.2.3 标准曲线法
标准曲线法是用不同梯度的标准源作标准曲线，选线性回归范围内的一点做为被测样品的试验点，制作被测样品的线性方程，同样根据两条直线的斜率比来计算被测源的生物学利用率。
2.2.4 平均值比法
平均值比法适用于两种或多种微量元素作比较，但缺乏共同的对照点(x=0)时，可选用反映指标平均值相比的方法。当添加元素占饲粮中该元素的主要比例时，该法精确度高；如果占的比例很少时，则意义不大(Littell等，1995)。
2.3 同位素法
1896年人类就发现了天然放射性核素，1924年Gorge De Hevesy第一次将放射性同位素应用于动物研究，但直至20世纪50年代，放射性同位素法才广泛应用于动物代谢和临床研究[27，28]。放射性同位素法是通过测定标记矿物元素在体内组织中的贮存含量来测定矿物元素生物学利用率。这种方法可以反映微量元素在体内的分布情况，主要优点表现为:①灵敏度高，放射性的检测水平可达10-18～10-19g，而普通化学分析法的灵敏度只有10-12g；②可以在整体正常生理条件下进行研究；③操作简单，样品可直接测定，不需要繁琐的前处理；④放射性核素的引入量低，比较接近动物体正常的生理状态；⑤试验期大大缩短。放射性同位素法大大提高了试验的准确性，平衡试验中若引入放射性同位素，可以测定锌的真吸收率。Judith(1986)采用65Zn平衡试验测定了老年人锌的真吸收率为17%；而年轻人为31%。 Weigand[(1980)给大鼠每千克体重饲喂56～141mg范围的6个水平锌，发现锌的真吸收率随锌水平的升高而增加。从理论上讲该法最理想，但要求一定的设备，饲料成本也高，虽然在测定饲料原料中矿物元素生物学利用率方面应用广泛(ODell, 1984、1985)，但在有机微量元素生物学利用率测定方面应用不多，只有Hill等(1987)利用肠灌注法测定了蛋氨酸锌对鸡和猪的生物学利用率，这可能与有机微量元素添加剂在普通饲粮中测吸收率的准确性不高有关。将同位素法与其它试验方法结合起来，可更准确的研究微量元素的吸收、利用和影响因素，总结前人的研究方法，可将同位素法分为体外法和体内法两类。
2.3.1 体外法
体外法主要有两种：外翻肠囊法和小肠刷状缘膜微粒(Brush Border Membrane Vesicles， BBMV)法。
2.3.1.1 外翻肠囊法
外翻肠囊技术是在体外培养肠环技术上发展而来的，即从活体取出将要研究的肠段，分割成不同的片段，将各片段外翻做成囊状物，放入培养液中培养一段时间后，取出放进装有被测物的烧瓶中，观测肠道粘膜、浆膜及肠体中被测物的变化。由于同位素法的应用，才使应用外翻肠囊技术研究成为可能。Manis和Schachter (1962)首次用外翻肠囊技术研究了小肠对铁的吸收。Hopping(1963)用此技术研究螯合剂对59Fe被大鼠吸收和在体内分布的影响后指出，外翻肠囊技术是研究铁吸收的一种有效方法。Emes (1975)采用外翻肠囊技术研究了大鼠小肠锌最大吸收部位。Seal(1983 )则用该方法研究了锌吸收的影响因素。该方法操作简单、快速且耗费低，能详细地观察到元素进出肠粘膜的变化规律，从而使人们能够深入地了解微量元素在小肠内被吸收的特点。但该方法是在没有血液供应的非正常生理条件下进行的，肠粘膜没有营养供应，试验结果只能表示摄入而非吸收。我们不可能完全模拟体内的生理条件进行培养，因此，此时小肠的功能不能正常发挥。
2.3.1.2 小肠刷状缘膜微粒(Brush Border Membrane Vesicles， BBMV)法
该法是将所研究的肠段取出后，轻轻刮下粘膜，经离心等一系列的处理得到刷状缘膜微粒，刷状缘制品的纯化程度可通过蛋白和特殊酶活的测定来判定。刷状缘制品在培养液中培养一段时间后，快速过滤，通过测定滤纸上的放射性元素来估测刷状缘对微量元素的摄入。Menard (1983)应用该技术研究不同锌浓度下，锌的摄入及体内锌贮对刷状缘膜锌吸收的影响，发现锌的吸收在0.2mmo1/l时是饱和的，在1mmol/l时是不饱和的。刷状缘锌转运系统受动物体内锌贮的影响。
2.3.2 体内法 根据被测元素的引入方法，可以将体内法分为两类：一类是直接采食或通过胃管引入；另一类是小肠灌注，前者主要用于人的研究。Wastney (1986)应用该方法，通过测定粪尿、血液、肝器官等中同位素的放射性，研究了人对锌的代谢动力学模型及血液锌池的大小。据报道，通过精确计量的采食或胃管给研究对象投入含Fe的食物，然后测定同位素的全身计数(whole-body counting)、血液及某些器官中同位素的放射性，同时监测一些血液学指标和肝脏、脾脏等器官总铁浓度，以评价人对铁的吸收利用情况。 原位结扎灌注技术是指将动物麻醉后，打开腹腔，将试验肠段两端结扎，肠段中引入被测元素灌注液，一段时间后，通过测定被测元素的消失率，结扎肠段粘膜上被测元素的放射性，血液组织器官中元素的放射性来估计被测元素的吸收、转运和利用。Darrell(1965)在其研究中详细描述了该技术。由于其具有试验期短(几分钟至几小时)、操作简单、在动物体内进行等特点，该技术得到研究者的广泛应用。
2.4 细胞培养技术
细胞培养是指人为地从体内取出细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使细胞能够继续生存、生长、繁殖并维持结构和功能的实验技术。运用细胞培养进行研究有其独特的优点[4，34]：①离体培养细胞脱离了有机体复杂的环境因素的影响，可以很方便地控制试验条件，进行单因子测试；②细胞均质，类型单一，对外界影响的反应一致；③可供比较不同因素或同一因素不同剂量对同一种细胞的作用；④细胞可直接暴露在预测试剂中，细胞发生的变化可以直接被观测，及时反映出来。 尽管细胞培养技术有很多优点，但在人工培养环境下的细胞反应和体内细胞环境相比毕竟有很大差异，所以不应视为与体内细胞完全一样。国外研究者将细胞培养与同位素示踪技术有机结合用于研究，已经获得成功。有研究者利用CACO-2细胞(A human colonadenocar-cinoma cell line)在有牛胎儿血清存在的条件下，研究了锌的摄入和跨细胞运动，结果表明，锌在细胞两侧跨细胞速度不一样，顶膜(Capical )锌摄入是非饱和的，而基底侧(baso cateral)对锌的摄入是饱和的。
近年来，由于我国细胞生物学技术发展迅速，同时借助于同位素示踪技术，使得将细胞培养技术用于动物营养研究中成为可能。但是，关于这方面的报道甚少，分析其原因可能是技术含量要求高，要求的试验仪器昂贵、费用大等，所以，到目前为止还很难推广应用。 综上所述，研究矿物质微量元素生物学效价技术具有多样性，因此，所需条件也各不相同。鉴于此，研究者应根据自身的研究目的和所具备的试验条件来选择试验方法。近年来，结合放射性同位素示踪技术是研究微量元素在动物体内吸收利用、分布特点及影响因素行之有效的方法。但是，同位素示踪技术要求测试设备昂贵，标记物来源有限，还有安全问题等，使其利用受到限制。但随着科学技术的发展、综合性学科的出现以及各国研究者坚持不懈的努力，在不久的将来，必将克服这些缺点，使之得到更广泛的应用。必将研究出具有操作更简单、结果更准确、费用更低廉等优点的测定微量元素生物学效价的方法。
3 影响微量元素吸收利用的因素
近年来，人们对影响微量元素吸收利用的因素进行了大量的研究和探讨。借助于一些新技术(如同位素示踪技术、组织培养技术、细胞培养技术)和手段(放免分析)，人们对影响微量元素吸收利用因素的研究进展迅速，归纳起来主要有饲料方面、动物自身方面、评定指标的选择和微量元素的化合物形式方面。
3.1 饲料方面
饲料中矿物质微量元素的含量，还有日粮中的某些成分都会影响微量元素的吸收利用。总结多年来的研究成果，可以把影响因素分为两类——抑制剂和促进剂。抑制剂如纤维素、植酸、某些矿物元素、某些抗营养因子(单宁、棉酚等)。有研究报道，粗纤维与锰的利用率呈明显的负相关。一般来说，随着植酸水平的增加，肉仔鸡对锰吸收水平显著下降。李杰(1992)试验指出，饲粮中植酸水平为0.8%时，足以使全鸡及胫骨中锰含量极显著下降。饲料中某些矿物元素，如铜、锌、锰和钴由于与铁具有相似的生理生化特性，通过吸收结合位点的竞争，影响铁的吸收(Underwood， 1977)。在动物机体内，微量元素铜在铁的代谢过程中起着非常重要的作用[38]。饲料中有些成分对铁的吸收利用起促进作用，如抗坏血酸(VC)、维生素A、蛋白质及其降解产物、某些氨基酸、某些有机酸和糖类等。研究者早在六、七十年代就已经发现氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用。较为一致的看法是：氨基酸或小肽可与锌在小肠中形成可溶的锌-氨基酸螯合物或锌-小肽络合物，该物质在肠段中不受植酸等因素的影响，并能以氨基酸和小肽的吸收模式转运，提高了锌的利用率。
3.2 动物自身方面
不同种类动物对矿物质微量元素的吸收利用差异很大。Schricker (1981 )在研究中发现，向日粮中加入VC显著提高人对铁的吸收利用，而大鼠表现的没有那么明显。Elliott(1977)研究报道了大鼠和仔猪之间铁吸收利用的差别很大。同种动物不同品种间、同品种不同性别间对铁吸收利用无明显差异。有资料证实，动物体内铁的营养状况不同，铁的吸收利用情况也不同；另外，动物的胃肠道环境也影响铁的吸收。动物的不同生长阶段对微量元素利用也有影响，据报道，蛋氨酸锌对肉鸡的生长具有一定的促进作用，主要表现在试验的前期。
3.3 评定指标的选择
大量的试验对微量元素的生物学效价的敏感指标进行了研究，不同研究者采用的指标各异，主要有生产性能指标(日增重、采食量和饲料转化率)、骨骼发育(胫骨)指标、血清指标(血清中无机锌的浓度、碱性磷酸酶活性、ALP、血清锌结合不饱和率)、外观指标等。 生长速度是早期评定微量元素利用率的最基本指标，但为非特异性指标。在测定时通常需要使用纯合或半纯合饲粮，不仅成本高，而且测定结果不一定适合含有天然原料的实用饲粮。近年来出现的大剂量添加微量元素法使添加量远远超过了动物的生理需要量，使生长速度作为微量元素利用率评定指标的准确性更低。特定敏感组织中的矿物元素积累是用斜率比法评定微量元素化合物生物学利用率时最常用的评定指标。许多学者在纯合、半纯合饲粮中添加低含量微量元素，以组织或血液中该元素的含量评定了有机锌、有机铜相对于无机硫酸盐的相对利用率。微量元素在体内的代谢途径和功能不同，特异性敏感指标也不同[44]。以往的研究表明，采用不同的指标，所得的结果也不同。因此，评定指标的选择对于评价微量元素的生物学效价特别重要。
3.4 微量元素的化合物形式
微量元素在饲料中的添加形式一般有3种：无机态、有机酸、氨基酸和蛋白质络合物形式。以锌元素为例，锌在体内主要以有机结合态进行吸收、转运、储存和利用。无机锌只有转化为有机态，才能被机体利用。因此，无机锌的生物学效价取决其转化成有生物活性的有机锌的能力。目前研究最多的是氨基酸螯合锌。Lowe( 1996)报道，螯合锌由于其独特的结构，与无机锌的吸收机制可能不同。Wedekind的试验表明，与硫酸锌(100%)相比，根据日粮的复杂程度，蛋氨酸螯合锌的生物学效价在117%～206%之间。其它元素关于这方面的报道也很多。但就目前而言研究最多的还是氨基酸螯合物，今后随着技术的成熟，这种方法必将得到广泛的应用。
4 小结
随着科学技术的快速发展，饲料中矿物质微量元素生物学效价的评定方法趋于一致，研究的结果也呈现出一致性，但由于某些因素的存在往往还有一定的差异性。今后的研究应着重分析哪些因素是重要的以及找到最合适的评定体系。也许人们可以从细胞水平和分子水平的研究中为饲料中矿物质微量元素生物学效价的评定找到理想的答案。王 群 刘艳芬
