益生素是以活菌成分为主的饲料添加剂。它的主要机理在于给动物直接饲喂微生物的活菌制剂，以平衡动物的肠道菌群，加强肠道微生物的屏障功能，减少有害菌群的毒害作用，提高机体免疫力，同时分泌酶等一些有益的代谢产物，提高饲料的利用率，从而使动物健康快速生长[1，2]。作为益生菌的一种，枯草芽孢杆菌在动物生产中的研究与应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。枯草芽孢杆菌能产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以及维生素等有益代谢产物。我们在益生素的研制过程中分离到一枯草芽孢杆菌N株，并对其发酵代谢产物进行了测定，为揭示芽孢杆菌促进生长、提高饲料转化率的机理提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 菌种为枯草芽孢杆菌N株：由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院分离并保存并经中科院微生物所鉴定。 液体种子培养基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000 mL、pH7.0,0.1MPa灭菌30min。产酶培养基:玉米粉5%、麸皮3%、豆粕2.5%、硫酸铵0.5%、氯化钙0.05% 、pH7.0,0.1MPa灭菌30min。 主要仪器：气相色谱仪GC-9A、RF-5301PC荧光光度计（日本岛津）、UV-2000型紫外分光光度计、恒温水浴锅、高速离心机、1/万分析天平、蒸气消毒器、控温摇床。 1.2 方法： 1.2.1种子液制备 每250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，在0.1MPa灭菌30min，冷却后从斜面接一环菌苔至种子培养基，置37℃控温摇床（220rpm）培养，至芽孢率达90%以上时停止培养，约需24小时。 1.2.2 接种与培养 取1mL种子液，接入盛有100mL无菌产酶培养基的500mL三角瓶中（接种量为1%，v/v）。置摇床中37℃振荡培养至芽孢率达95%以上时停止发酵。 1.2.3 粗酶液的提取 将发酵液于3500rpm下离心20min，取上清液为粗酶液。 1.2.4 淀粉酶活力的测定[3]：采用细菌α-淀粉酶活力的测定方法。淀粉酶活力单位(U)：1mL酶液在60℃，pH6.0的条件下，每分钟液化1ug可溶性淀粉的酶量为一个酶活力单位。 1.2.5 蛋白酶活力的测定[3]：采用福林-酚法测定。蛋白酶活力单位(U)：1mL酶液在40℃，pH7.5（碱性蛋白酶为pH11.0）的条件下，每分钟水解酪蛋白为1ug酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。 1.2.6 脂肪酶活力的测定[3]：脂肪酶在一定条件下能将甘油三酯水解释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油，脂肪酸用标准碱液滴定，用滴定值表示酶活力。脂肪酶活力单位(U)：1mL酶液在40℃，pH7.5的条件下，每分钟产生1ug脂肪酸的酶量为一个酶活力单位。 1.2.7发酵液中挥发性脂肪酸的测定：将芽孢杆菌发酵液以3500rpm离心20min，取上清夜用气相色谱仪进行乙酸、丙酸和丁酸的含量测定。采用FFAP柱，氢焰检测器，柱温150℃，汽化室温为200℃，量程为10-9，衰减度为16；N2做载气，流速为40ml/min，H2流速为35ml/min，空气流速为250ml/min。将所得到的峰面积与标准样在相同条件下得到的峰面积比较，求得样品中乙酸、丙酸和丁酸的含量。 1.3.5 发酵液中维生素C的测定：将芽孢杆菌发酵液以8000rpm离心10min，取上清夜，用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定发酵液中的维生素C含量。 1.3.6 发酵液中维生素B1的测定：将芽孢杆菌发酵液以8000rpm离心10min，取上清夜，用荧光法在激发波长332nm、发射波长392nm处测定荧光强度，其荧光强度与发酵液中的维生素B1含量成正比。 1.3.7 发酵液中维生素B2的测定：将芽孢杆菌发酵液以8000rpm离心10min，取上清夜，用分光光度计法在444nm处测定发酵液中的维生素B2含量。 1.3.8 发酵液中维生素B6的测定：将芽孢杆菌发酵液以8000rpm离心10min，取上清夜，用荧光法在激发波长326nm、发射波长395nm处测定荧光强度，其荧光强度与发酵液中的维生素B6含量成正比。 2 结果 2.1 各种酶活力的测定结果：该芽孢杆菌发酵液中淀粉酶活力为576U ；中性蛋白酶活力为220U ，碱性蛋白酶活力为20.6 U，脂肪酶活力为7.1 U 。另外还有少量的纤维素酶和植酸酶。 2.2 挥发性脂肪酸的测定结果：该芽孢杆菌发酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量分别为0.225g/L、2.59g/L、3.49g/L。 2.3 各种维生素的测定结果：该芽孢杆菌发酵液中VC的含量为0.878mg/L，VB1的含量为21.33 mg/L，VB2的含量为9.31 mg/L，VB6的含量为0.204 mg/L。 3 讨论 3.1 枯草芽孢杆菌N株在其生长繁殖过程中能够产生淀粉酶、蛋白酶和少量脂肪酶、纤维素酶、植酸酶等酶类。动物饲料中添加该芽孢杆菌制剂，在其肠道中将产生以上消化酶，促进动物对营养物质的消化吸收，提高饲料转化率。另据报道芽孢杆菌在动物肠道中还可产生氨基化氧化酶及分解硫化氢的酶类，可将吲哚类氧化成无毒、无害的物质，从而降低动物舍内氨气、硫化氢、臭气的有害气体的浓度，减少环境污染。 3.2 枯草芽孢杆菌N株在其生长繁殖过程中能够产生乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸，这些物质能够降低动物肠道pH值，可有效抑制有害菌的生长，为乳酸菌的生长创造了酸性条件。另外丙酸还能够参入三羧循环，为动物提供能量。 3.3 枯草芽孢杆菌N株在其生长繁殖过程中能够自身合成VC、VB1、VB2、VB6 ，为动物提供营养物质，从而促进动物生长和提高其生产性能。 3.4本研究证明了芽孢杆菌进入动物肠道，除了发挥益生素预防疾病的功能外，还能够产生各种消化酶，促进营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，为动物提供营养物质，促进生长。为今后更加合理的使用芽孢杆菌制剂提供了理论依据。
