黄霉素的介绍及检测方法

中文摘要：

文章将药物含量分析领域中的常用的两种方法作了适当比较，在药品生产企业中，微生物法检测药物效价，高效液相色谱检测药物的有效含量已成为本行业中通用的分析手段，两种方法各有所长，微生物检测药物效价能真实直接地体现出药物的生物抗菌能力，但对鉴别药物组分显得有些力不从心，高效液相色谱法却能直观的看到药物不同组分的分布情况，易于辨别产品的成分间差异，在生产和使用中，将两种检测方法合理的结合起来，必将对药物产品质量控制起到良好的监控作用。

中文关键词：黄霉素  微生物法检测  高效液相色谱法

1 黄霉素一般介绍^[1]

1.1 黄霉素属于磷酸多糖类抗生素，又名：黄磷脂素  Flavophosphlipol、斑伯霉素  Bambermycin、默诺霉素A Moenomycin-A、黄磷脂醇。化学分子式：C₇₀H₁₂₁N₅PO₄₀

饲料添加剂为褐色或暗褐色无定形粉末，又特异气味，溶于水，甲醇，二甲基甲酰胺，不溶于苯，氯仿，无明确熔点，200℃分解。

1.2 来源

1965年由美国赫司特（Hoechet）公司开发的，它是由Streptomyces bambergiensis菌发酵而产生的抗生素。它至少有4个组分，有A,B₁,B_a,C,以默诺霉素A为主。

1.7药理^[2]

黄霉素为磷酸化多糖类抗生素，具有抗菌作用机理，是通过干扰细菌细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖，黄霉素的促生长原理可能在他能提高饲料中能量和蛋白质的消化，能使肠壁变薄，从而提高营养物质的吸收，能有效地持续肠道菌群的平衡和瘤胃PH值的稳定。细菌对黄霉素不易产生耐药性，黄霉素也不容易与其他抗生素产生交叉耐药性。黄霉素抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效，且对其他抗生素耐药的革兰氏阳性菌也有效，但对革兰氏阴性菌作用很弱。黄霉素经口投药后几乎不被消化道吸收，24小时后几乎全部由粪便排出。

黄霉素只用作饲料添加剂，不作为治疗用药，具有抗生素类添加剂的防病和促生长等作用，在动物消化道内不吸收，不会在体内和产品中有残留，因而公认它是安全而无公害的。也有人把黄霉素称作“绿色”抗生素。^[3]

2 黄霉素含量检测方法的探讨

由于黄霉素在饲料领域的广泛应用，对饲料中黄霉素含量的检测工作也就越发重要；目前国家还有相关的检测标准出台，根据多年从事饲料抗生素检测工作的经验，加之多年来对黄霉素效价的检测经验，分别运用微生物抗生素效价检测法和高效液相色谱检测法对黄霉素含量进行检测，

2.1微生物检测法

2.1.1原理：根据AOAC（美国公职分析化学家协会公定分析方法）上推荐的一剂量试验设计方法^[4] 或中华人民共和国兽药典推荐的二剂量试验设计方法进行抗生素含量的微生物法检测^[5]。

2.1.2 试验条件^[6]

1）试验菌种：金黄色葡萄球菌 菌号：26003 Staphylococcin aureus

2）缓冲溶液：磷酸缓冲溶液Ph 6.0 : 8g 磷酸二氢钾和2g磷酸氢二钾溶解于1000ml 蒸馏水。

3）培养基：营养琼脂培养基

4）培养温度：37℃ 18—20 hours

2.1.3样品处理

称取适量对照品,溶于甲醇,贮存于棕色瓶, 可在4℃ 保存10天。 磷酸缓冲溶液作为稀释液，稀释到所需的适当浓度（推荐在25-50ppm）。

称取适量待测样品,溶于1：1甲醇水溶液,磷酸缓冲溶液作为稀释液，稀释到所需的适当浓度（推荐在25-50ppm）。

2.2 高效液相检测法

2.2.1原理

    采用反相色谱柱进行分离，并用紫外检测器进行检测；以与预测组分同质的物质作参照物，根据样品量和参照物的量，以及预测组分和参比物的响应信号进行定量的方法---（外标法）。

2.2.2 试验条件

高效液相色谱仪  Waters；色谱柱：Dianosil C₁₈  5um 200*4.6mm；流动相：乙腈 : 甲酸铵0.2%水溶液 = 45 ：55  (用10%磷酸调PH 4.9)；流速：0.7ml/min；保留时间: 13min； 进样量：20μl。

2.2.3 样品处理

称取适量对照品,溶于甲醇,贮存于棕色瓶, 可在4℃ 保存10天。 磷酸缓冲溶液作为稀释液，稀释到所需的适当浓度（推荐100ppm）；称取适量待测样品,溶于1：1甲醇水溶液,磷酸缓冲溶液作为稀释液，稀释到所需的适当浓度（推荐80ppm）。

2.2.4 图谱

图谱中分别在10.66min,11.65min,13.93min,14.73min,15.75min 被记录的峰为黄霉素的组分，其中11.65min的峰为黄霉素组分中的默诺霉素A。

3 检测方法的比较

    微生物效价检测法（以下简称为生测）主要适用的检测样品为饲料添加剂原料。要求有效含量较高，不适于微量的检测。生测所体现的是药物的生物学活性程度，对于黄霉素来说，生测所体现的效价含量是黄霉素产品中所有药物组分的生物效价之和（包括A,B₁,B_a,C,其中A为主要成分），有很强的实用性。但此方法所需时间较长，对于检测的样品中组分异常情况无法监测。

    高效液相色谱法适用于检测饲料添加剂原料和预混合饲料产品。此法可对黄霉素含量低的样品进行检测。将黄霉素不同组分经过色谱柱的保留时间不同进行分离，呈现出2.2.4图谱的效果。峰面积最大的组分为以默诺霉素A，其峰面积为黄霉素五个组分峰面积之和的50%以上，黄霉素组分1，组分2，组分3，组分4峰分别为黄霉素A峰相对保留时间的0.9，1.1，1.2，1.3。根据一段时间的检测发现，不同黄霉素生产厂商生产的黄霉素各组分分布比例是不完全相同的，与对照品中各组分的比例也不相同。由此可见，高效液相色谱法可直接鉴别多组分抗生素的组分分布情况，直接了解多组分抗生素的质量情况，同时可根据图谱的特异性鉴别不良组分的干扰情况。

综上所述，在黄霉素含量检测工作中将两种方法结合起来是十分必要的。两种方法相互补充，为我们的检测工作提供有力的帮助。

两种方法对同一个质量稳定产品的检测结果不存在较大相差，含量比较见表1。

表1

以上所介绍的方法是目前抗生素药物检测中常用的两种方法。生物检测所需仪器设备简单，但要求操作者具备有一定的检测技能和试验经验，因为在此类检测方法中所存在的影响因素较多，控制其需要一定经验基础。对于高效液相色谱检测法来讲，要求实验室具备此类实验所需的检测设备，对于具有一定HPLC的检测经验的人员讲，实验条件操控起来相对较容易，影响因素易控制，实验稳定性较好。由以上的图谱可看到，只要将主峰与其它峰分离开，就可得到满意的实验结果。

综上所述，在黄霉素含量检测工作中将两种方法结合起来是十分必要的。两种方法相互补充，为我们的检测工作提供强有力的帮助。