4种日粮条件下30～150日龄羔羊瘤胃液原虫和细菌数量的变化

       不同蛋白质和能量水平日粮条件下30～150日龄羔羊采食、消化、体增重和瘤胃消化代谢的变化，并认为100日龄是羔羊消化发育的一个转折点（朱文涛等，2004），作者则报道在如上条件下羔羊瘤胃原虫和细菌的数量变化。?

　　1　材料与方法

　　1.1　试验动物与饲养管理　

　　将16只30日龄体重约6～10 kg罗姆尼与新疆美利奴羊杂交公羔, 装置永久性瘤胃瘘管，瘘管直径为2.5 cm。术后护理5～7 d后随机分为4组（1、2、3和4组），每组4只，分别喂以4种不同的日粮(表1)。所用动物在一出生后即训练采食。在试验期间动物单圈饲养，将日粮充分混合后每天在8：00和19：00分2次平均定量喂给，自由采食，自由饮水。

　　４种日粮的组成及营养成分见表1, 主要参照NRC标准（1975）和Hoover等（1991）配制。第1组动物喂以高能高蛋白质水平日粮（日粮1），第2组动物喂以高能一般蛋白质水平日粮（日粮2），第3组动物喂以一般能量但高蛋白质水平日粮（日粮3），第4组动物喂以一般能量和蛋白质水平日粮（日粮4）。表1中所列日粮的有机物、粗蛋白质、纤维素、半纤维素、钙和磷的含量均为实测值，可消化能（以下简称能量）系根据中国农业科学院畜牧所中国饲料成分及营养价值表中的绵羊数据估算而得。?

　　1.2　瘤胃液样品的采集与处理　

　　以每15 d为一研究时间段，在每个时间段的第9、10和11 d，连续3 d，在每天第1次喂料后的第0、1、3、6和9 h采取瘤胃液样品，测定pH后用双层纱布过滤，取20 ml过滤液加2滴饱和氯化汞，混匀后密闭于-20℃保存备用。?

　　1.3　瘤胃液微生物的计数

　　1.3.1　瘤胃液原虫的计数　

　　在计数前预先配制?1号?固定液（4%福尔马林40 ml，NaCl 9.0 g，蒸馏水960 ml）、2号固定液（冰醋酸0.3 ml，蒸馏水?99.7 ml?）和M.F.S溶液（35%福尔马林100 ml，NaCl8.0 g，甲基绿0.6 g，蒸馏水900 ml）。?

　　将瘤胃液样品摇匀，用2层医用纱布过滤去掉大块食物和杂质。取1号、2号固定液按1∶2比

例混匀，取混合液和瘤胃液样品等量(0.1 ml)并混匀，然后用M.F.S溶液倍比稀释。为便于

镜检通常将瘤胃液稀释至20～50倍（稀释倍数以每方格内平均有?5个?左右虫体为宜）。

用10×40倍显微镜计数。?

　　测数用血球计数板，但因通常的计数室深为?0.1 mm?，大型虫体不能进入室内，从而减少了对原虫的计数，所以在镜检前将其改装成0.5 mm深（卢德勋等，1999）。1个血球计数板有2个计数室，每个计数室有8个大方格，每个大方格内有16个小格。?1个?大方格面积为1mm?2。?

　　用管孔口径大于1.0 mm的吸管将摇匀的样品稀释液以连续不断的流液充满计数室，静置2 min后镜检。对四边压线的虫体按计上不计下，计左不计右的原则来处理。同一样品计数4次，取其平均值。按下列公式计算每毫升瘤胃液中原虫数量：原虫数/ml=X/S×D×2×1000?其中：　X为所有方格中的原虫总数，S为计数方格数，D为稀释倍数。?

　　因计数室每个大方格面积为1 mm?2，乘以?0.5 mm?（计数室深度）等于0.5 mm?3，换算

成1 cm?3?（1 ml）?则需乘以2×1000。?

　　1.3.2　瘤胃液细菌的计数　

　　将瘤胃液样品摇匀，用2层医用纱布过滤去掉大块食物和杂质后，取瘤胃液样品(0.1 ml)和95%酒精按1∶2比例混匀，然后用结晶紫溶液倍比稀释。为便于镜检，稀释度一般控制在每小格菌数30～150个。?

　　用吸管将摇匀的样品稀释液以连续不断的流液充满计数室，静置3～4 min用10×100倍油镜观察，并且显微镜需安装测微尺以观察细菌大小。对四边压线的细菌按计上不计下，计左不计右的原则来处理。同一样品计数4次，取其平均值。按下列公式计算每毫升瘤胃液中细菌数量：?

　　细菌数/ml=X/S×D×16×10×1000?

　　其中：X为所有方格中的细菌总数，S为计数方格数，D为稀释倍数。?

　　因计数选择计数板凹槽为0.1 mm，所选方格面积为0.0625 mm?2，换算成1 cm?3则需乘以16×10×1000。?

　　细菌的分类：瘤胃液细菌计数分类参照斯塔尼尔等（1983）和陆承平（2001）的方法，即将细菌分为大杆菌、小杆菌、球菌、链球菌和新月芽菌分别计数。?

　　将3 d中每天5个时间点共计15个瘤胃液样品计数结果的平均值，作为该研究时间段饲喂不同日粮的各动物个体的数据。?

　　1.3　统计分析　

　　数据的统计分析采用SPSS11.0版统计软件中Analyze菜单下Compare Means模型中One?Way A　NOVA模块进行。

　　2　结果
　　
　　2.1　4种日粮条件下30～150日龄期间羔羊瘤胃液原虫数量的变化
　
　　如表2所见，羔羊瘤胃液原虫数量明显地随日龄而不断增加，并且到120日龄时原虫的数量即已基本稳定，约为试验初期的4～8倍。在75～90日龄段，羔羊瘤胃中的原虫数量增加迅速，而对于高能量日粮（日粮1和2）而言，在105～120日龄，还有第2个原虫数量迅速增加的时段。在105日龄之后，日粮的能量水平明显影响瘤胃原虫的数量，就120 ～135日龄羔羊而言，在高能量日粮瘤胃液原虫数量要比一般能量日粮的多27%（日粮1比日粮3）（P<0.05）和18%（日粮2比日粮4）（P<0.05），而日粮蛋白质水平对瘤胃液原虫数量的影响则不明显。?

　　2.2　4种日粮条件下30～150日龄期间羔羊瘤胃液细菌数的变化

　　羔羊瘤胃液细菌总数随日龄而不断增加（表2），基本上持续到120～135日龄以后，从30～150日龄羔羊瘤胃液的数量增加了0.5～3倍。日粮能量和蛋白质水平对瘤胃液细菌总数的影响

在本试验不明显。?

　　羔羊瘤胃液中大杆菌的数量随日龄而不断增加，而且一直持续到试验末期即135～150日龄，比试验初期增加了2～5倍。由表2可见，日粮的蛋白质水平影响瘤胃液大杆菌数量，而日粮的能量水平对大杆菌的数量则无显著影响。?

　　羔羊瘤胃液小杆菌的数量也是随动物的日龄而不断增加，到135日龄之后则相对稳定下来，比试验初期增加了0.5～3倍。日粮能量和蛋白质水平对瘤胃液小杆菌数量的影响在本试验不明显。

　　羔羊瘤胃液中的球菌、链球菌的数量也均随着动物的日龄而不断增加，但在105日龄就已基本稳定。并且日粮的能量和蛋白质水平对瘤胃液球菌、链球菌数量的影响在本试验亦不明显。?

　　瘤胃液新月芽菌在试验初期随动物日龄而增加，但在75日龄后其数量的变化与动物的日龄、日粮中能量和蛋白质的含量，均无显著的相关关系。?

　　3　讨论　

　　3.1　羔羊日龄与瘤胃液原虫、细菌数量的关系　

　　瘤胃微生物包括原虫（即纤毛虫）、细菌、真菌和噬菌体4类。本试验结果清楚地表明，羔羊瘤胃液原虫和细菌数量是随着动物的日龄而增加的，提示了瘤胃微生物消化是一个不断发育的过程，但同时也表明各种微生物数量变化的差异性，从总体看，原虫和细菌总数在120日龄即已基本稳定，但在整个试验期原虫的增量比细菌要大，而且不同形态的细菌的增速和到达基本稳定的日龄也不相同。如果考虑到在试验期瘤胃液体积也增加了15倍，瘤胃细菌数则增加了30倍以上，而原虫数增加了60倍以上。?

　　在试验初期的30～45日龄，羔羊瘤胃液中即有一定数量的原虫和相当数量的细菌，表明在这

之前瘤胃的微生物消化功能就已开始形成。?

　　3.2　羔羊日粮能量、蛋白质水平与瘤胃液原虫、细菌数量的关系
　
　　显而易见，日粮的能量水平影响瘤胃液中原虫的数量，日粮中可消化能量高，原虫数量就多，而蛋白质水平的影响就不明显。除了瘤胃大杆菌数量受日粮的蛋白质水平影响之外，日粮的能量、蛋白质水平对瘤胃液细菌总数或其它各种细菌数量的影响不显著。因此可以初步认为羔羊日粮与瘤胃微生物的关系主要表现在日粮中可消化能量与原虫的数量关系上。

?
　　3.3　羔羊瘤胃液原虫、细菌数量与消化代谢的关系　

　　将羔羊对日粮中纤维素、半纤维素消化率随日龄的变化（朱文涛等，2004）与瘤胃原虫、细

菌总数和各种细菌数（除新月芽菌外）随日龄的变化相比照，可以认为瘤胃微生物数量的增加提高了动物对日粮中纤维素、半纤维素的消化能力。羔羊在60日龄后饲料转化率开始降低（朱文涛等，2004），从本试验结果看，是与微生物的数量，特别是原虫数量的增加有关。因此，研究怎样延缓瘤胃液中微生物数量的增加，特别是限制原虫数量的增加，可能是提高或保持羔羊较高饲料转化率的一个新途径。?

　　4　结论　

　　30～150日龄羔羊瘤胃液中原虫和细菌的数量随日龄而不断增加，其中原虫数量的增加多于细菌，在135日龄后原虫和除大杆菌外各种细菌的数量都已基本稳定。?

　　日粮中可消化能水平主要影响瘤胃液中原虫的数量，而对细菌的数量无显著影响。日粮的蛋白质水平对羔羊瘤胃液中原虫和除大杆菌外其它各种细菌数量影响不显著。