1.前言
纤维素酶是饲料用酶制剂中的常用酶种之一，可水解高分子的纤维素形成还原糖，因此可以用作饲料添加剂，来提高饲料的消化利用率。
由于各酶种在保存或饲料制粒高温处理过程中会有一定程度的失活现象，为了比较微丸型及粉状纤维素酶两种剂型的贮存稳定性及耐热性能，我们进行了同种纤维素酶的两种剂型样品在不同温度条件下的耐热性能，以及微丸酶在4%猪用预混料中的贮存稳定性实验，以期为公司微丸型纤维素酶的研制及市场推广作好准备。
2．材料与方法
2．1 实验仪器
精密pH计：±0.01pH；
电子天平：d=1mg；
紫外分光光度计UV-1601（日本岛津）；
烘箱；
恒温水浴锅；
2．2 实验试剂
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.8）；
DNS试剂；
10mg/ml CMC-Na溶液；
1%标准葡萄糖液。
2．3 实验材料
A：微丸型纤维素酶（溢多利公司生产）；
B：粉状纤维素酶（市售产品）；
4%猪用预混料料：（16%；磷：7%；食盐：7%；铜：6000ppm；铁：3500ppm；锌：4000ppm；氯化胆碱：2%；酸化剂：0.2%）
2．4 酶活测定
酶活力测定： 采用DNS法
酶活单位定义：在40℃，pH4.8条件下，每小时催化CMC-Na底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（μmol/hr）。
测定底物：10mg/ml CMC-Na溶液
酶液制备：分别准确称取1.000g样品酶制剂，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至500mL，摇匀，静置提取，过滤后得到该纤维素酶提取液，然后稀释适当倍数备用。
DNS标准曲线的制作：精确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄（AR）1.0000克，配成10mg/ml浓度的标准葡萄糖液。分别吸取10mg/ml标准葡萄糖液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升分别含有葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的标准液。各取不同浓度标准液0.5ml于试管中，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5ml，DNS试剂3 ml于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀，冷却后，于紫外分光光度计550nm处比色，以所得的光密度OD值为纵坐标，以对应的葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。
空白的制作：以0.5ml蒸馏水代替0.5ml标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。
3． 实验设计
3．1 耐热性对比研究
3．1．1处理时间相同（10min），处理温度不同
1．每种样品按处理温度70℃、80℃、90℃、100℃不同分别称取1.0g，并按 1：1的比例分别添加1.0g淀粉；
2．加水至样品混合物的总湿度为17%，然后将各样品按温度不同进行处理，时间均为10min，处理完后迅速冷却至室温；
3．测定处理后样品的剩余酶活力；
4．以未经处理的样品酶活力为100%，其余经过处理的酶活力与之相比得到的百分比即为该酶的相对剩余酶活力；
3．1．2处理温度相同（85℃），处理时间不同
1．每种样品按处理时间2.5、5.0、7.5、10min不同分别称取1.0g，并按 1：1的比例分别添加1.0g淀粉；
2．加水至样品混合物的总湿度为17%，然后将各样品按时间不同进行处理，处理温度均为85℃，处理完后迅速冷却至室温；
3．测定处理后样品的剩余酶活力；
4．以未经处理的样品酶活力为100%，其余经过处理的酶活力与之相比得到的百分比即为该酶的剩余相对酶活力；
3．2 贮存稳定性研究
1、将微丸型纤维素酶按1：1的比例同4%猪用预混料（含酸化剂、胆碱以及高浓度的微量元素）混合均匀，并分装好置于贮藏室在室温条件下贮存；
2、按周期取样进行测定，并将微丸酶过筛除去预混料后进行酶活力测定。
3、以初始酶活为100%，其余与之相比所得百分比即为相对剩余酶活力。
4．实验结果
4．1 水分含量测定
表1.样品酶水分含量测定结果
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样品 |
微丸纤维素酶 |
粉状纤维素酶 |
|
含水量 |
7.25% |
7.65% |
4．2 耐热性对比实验结果
4．2．1 处理时间相同（10min），处理温度不同
表2. 微丸酶及粉状酶随温度变化的情况
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样品名 处理温度 |
微丸酶 |
粉状酶 |
|
未处理 |
100% |
100% |
|
70℃ |
99.1% |
98.6% |
|
80℃ |
97.2% |
95.4% |
|
90℃ |
96.9% |
91.2% |
|
100℃ |
92.0% |
84.3% |
由图表结果可以看出，微丸型纤维素酶同粉状酶相比，在温度不超过70℃时，耐热性能没有多大差别，但当温度超过80℃时，微丸酶的耐热性能要优于粉状酶制剂。因此在饲料制粒过程中（温度为85℃左右），微丸酶同粉状酶制剂相比酶活损失更小。
4．2．2处理温度相同（85℃），处理时间不同
表3. 微丸酶及粉状酶随处理时间变化的情况
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样品名 处理温度 |
微丸酶 |
粉状酶 |
|
未处理 |
100% |
100% |
|
2.5min |
99.8% |
98.1% |
|
5.0min |
98.6% |
97.2% |
|
7.5min |
97.8% |
96.7% |
|
10min |
96.1% |
94.8% |
自图表中的结果可以看出，在处理温度不变，处理时间变化的条件下，微丸型纤维素酶同粉状酶相比，耐热性能有一定程度的提高。
4．3 贮存稳定性实验结果
对贮存于4%猪用预混料中的微丸型纤维素酶按周期进行测定，实验结果如表4所示：
表4.微丸酶与粉状酶贮存稳定性对比
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产品 测定周数 |
微丸型纤维素酶 |
|
1 |
100% |
|
2 |
90.21% |
|
3 |
93.71% |
|
4 |
96.72% |
|
5 |
104.61% |
|
6 |
101.11% |
|
7 |
88.67% |
|
8 |
90.25% |
对贮存稳定性的实验结果进行分析可以发现，微丸型纤维素酶在4%猪用预混料中贮存8周后，其相对剩余酶活力总体是围绕95%~97%的轴线上下波动，说明其耐受高浓度矿添、胆碱、酸化剂等成分的抗逆性强，因而更适宜在预混料、浓缩料中使用。
5．结论
5．1 在相同的热处理条件下，微丸型纤维素酶的耐热性能同粉状酶相比，前者要优于后者。
5．2 在含酸化剂、胆碱及高含量微量元素的4%猪用预混料的贮存实验中，微丸型纤维素酶的损失过程不明显，贮存8周后，其相对剩余酶活力仍在90%以上，贮存稳定性高，适合于在预混料、浓缩料中使用。
