预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的研究进展

仔猪腹泻是困扰规模化养猪生产的主要难题之一，给养猪业带来了巨大的经济损失。致病性大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最重要的病原，其中产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic
Escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌（Morris等，1985；杨正时，1987；Yokayama等，1992；Alexander,1994；Hampson，1994）。Bergland（1980）报道，从断乳前腹泻仔猪中分离到ETEC的机率为45.6%，其频度比猪球虫(23%)和轮状病毒(20.9%)感染的总和还多。Alexander（1994）发现，由ETEC引起仔猪断奶前腹泻而造成的死亡率占仔猪死亡率的11％。同年，Hampson等另一项调查认为ETEC造成的仔猪断奶后腹泻平均每年就造成1.5%～2%的断奶仔猪死亡。王红宁等（1999）在1995～1999年间对四川等地规模化猪场的流行病学调查发现，由ETEC引起的仔猪黄、白痢的发生率达20％～60％，混合感染死亡率可达60％以上。

抗生素作为控制细菌感染的有效药物广泛应用于生产中，但抗生素的长期使用引起的耐药性问题和生产中超量使用抗生素的现象越来越突出，但控制效果却并不乐观。抗生素替代品的研究成为畜牧业发展的迫切需求。

初生仔猪和早期断奶仔猪自身免疫功能的不成熟以及早期断奶应激引起的免疫抑制，是造成仔猪对ETEC敏感性增高、抗病力下降，并引发ETEC感染性腹泻的主要因素。利用外源抗体为仔猪提供被动免疫从而预防和治疗肠道ETEC感染引起的疾病的研究将近已有一个世纪的历史，并证明了外源性抗体的有效作用。其中，鸡卵黄抗体因其化学性质稳定、特异性抗体含量高、安全性好、易规模化生产等特点，而越来越受到人们的注意，并有潜力开发为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂。近年来国内外的研究结果也证明，应用卵黄抗体防治由ETEC引起的仔猪腹泻，能够取得比较满意的效果。

根据抗原的制备方式，预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的生产方式可以分为两类：一类是直接用ETEC的菌体蛋白作为免疫原，而另一类则是将经分离纯化后的菌毛蛋白作为免疫原。有研究证明，后者免疫获得的卵黄抗体的应用效果优于前者（Kim等，1996；肖驰等，1998；Marquardt等，1999）。然而，由分离纯化后的菌毛抗原制备的卵黄抗体，其成本较高。通过基因工程技术，构建高量表达菌毛蛋白的大肠杆菌，为解决这一问题提供了有效的手段。本文拟对预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的研究进展进行综述。

1 卵黄抗体的特性及作用机理

自Klemperer于1893年首次报道鸡蛋中存在抗体以来，人们对蛋中抗体的研究不断深入。蛋内的抗体主要存在于蛋黄内，以IgG占优势，IgA和IgM的含量极低（Roth，1981；Locken，1983）。利用经过特异性免疫的母鸡来生产卵黄抗体，比从哺乳动物血液中获得的抗体具有突出的优越性：①易于生产。实际生产中，动物采血不仅对动物本身是极大的应激，且费时费工。鸡产蛋无伤害性和对佐剂不起像哺乳动物中出现的严重反应，因而方便得多；②产量高，成本低
。以一只母鸡为例，其年产蛋量为200～300枚，每只蛋中约含抗体100～150mg（Larsson，1993）；③卵黄抗体稳定性好，耐酸、耐碱、耐热（Losch等，1986；Shimizu等，1992；李学伍，2000），有利于运输、贮藏。

预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体对宿主特异性菌毛抗原有强烈的亲和力（Yutaka，1995），能够阻断或降低宿主特异性菌毛与仔猪小肠上皮的结合，使ETEC不能在小肠定居繁殖，从而阻断了大肠杆菌产生肠毒素，防止和减少仔猪腹泻的发生（Jin等，1998）。

2 预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体对仔猪腹泻的效果

尽管预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的生产方式不同，其机理都是通过特异性的卵黄抗体来阻断或降低大肠杆菌的宿主特异性菌毛与仔猪小肠上皮的结合（Jin等，1998），使ETEC不能在小肠定居繁殖和产生肠毒素，从而防止腹泻的发生。饲料中添加少量的卵黄抗体，可以显著地降低仔猪腹泻率，并在一定程度上提高动物的增重、饲料转化率。

一些研究者直接用大肠杆菌菌株免疫产蛋母鸡来获得卵黄抗体（胡子信，1994；李国平，2002）。李国平等（2002）用ETEC K88、K99、987P、F41标准菌株制成的灭活油佐剂作为免疫原，待产蛋鸡免疫后收集高免卵黄，然后提取、纯化，精制成鸡抗猪大肠杆菌特异性高免卵黄抗体并用于临床。结果表明该制剂安全性好，每头仔猪注射或口服2～4ml剂量，能有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻。而徐福洲等（2002）同样利用ETEC标准菌株制备灭活苗,免疫待开产母鸡，提纯卵黄抗体对攻毒仔猪口服治疗，结果显示治疗仔猪腹泻状况明显减轻，与对照组相比有显著差异；治疗组未出现死亡而对照组仔猪有33%～67%的死亡率。此结果表明，卵黄抗体治疗由ETEC所致的仔猪腹泻具有明显的效果。

另外一些研究者则采用分离出纯化后的大肠杆菌菌毛蛋白作为免疫原，通过多次免疫健康的产蛋母鸡，从而获得卵黄抗体。Yokoyama（1992）将提纯的ETEC宿主特异性菌K88、K99、987P制成菌毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫产蛋母鸡，抗体达到高效价后，收集鸡蛋从蛋黄中分离和喷雾干燥抗体，对不同ETEC菌株感染的初生未食初乳仔猪用适当的抗体治疗。试验中，所有仔猪接受不同菌株感染后12h内均发生中度或严重腹泻，用效价为1：625和1：2
500的抗体治疗仔猪全部存活，而对照组超过80%的仔猪死亡。同时，他们还研究了从鸡蛋卵黄中提取干粉抗体的方法。所提纯的卵黄抗体可以用于治疗仔猪大肠杆菌腹泻；使用前的保存和运输过程不需低温，使用方便而且效果比较可靠。Yutaka（1992）在饲粮中添加经ETEC
K99菌毛蛋白免疫得到的卵黄抗体，当效价为1：800和1：1 600时，能够有效治愈所有腹泻仔猪，并提高了仔猪的日增重。

本实验室用分离提纯的特异性菌毛抗原制备抗ETEC 的卵黄抗体，应用细菌体外粘附试验研究了卵黄抗体预防仔猪ETEC感染性腹泻的机制，并通过饲养试验研究了卵黄抗体预防断奶仔猪腹泻的效果。结果表明：在体外试验中，无抗体的对照组平均每个上皮细胞黏附16.4个K88ac；抗体效价分别为1：640和1：1
280的卵黄抗体较对照组均极显著抑制了K88ac对肠上皮细胞的黏附作用（P<0.01），平均每个上皮细胞分别仅黏附8.5和2.4个细菌，二者之间也存在极显著差异（P<0.01）；抗体效价为1：320的抗体组相对对照组有一定抑制细菌粘附作用，但差异不显著（P＝0.15）。用90头28日龄断奶仔猪进行了为期4周的饲养试验。试验以玉米—豆粕典型日粮为对照组，在对照组日粮中分别添加0.5％、1％、2％的喷雾干燥卵黄粉形成试验一组、试验二组和三组的试验日粮。添加1％卵黄抗体粉显著降低了料肉比和腹泻率（P<0.05），促进了试验期仔猪的平均日增重（P=0.052）。

Kim等(1996)曾分别以ETEC的K88菌毛和减毒菌株作为抗原制备卵黄抗体，并对其效价进行了比较，结果表明前者免疫得到的卵黄抗体效价明显高于后者。为比较由菌毛免疫和菌株免疫两种不同方法所得卵黄抗体的临床效果，肖驰等（1998）用这两种方法制备的卵黄抗体进行了临床预防和治疗试验；结果表明，两种卵黄抗体均能有效地预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻；但菌毛蛋白疫苗卵黄抗体的应用效果更好。

此外，部分研究者用多价菌苗免疫获得卵黄抗体，用于防治仔猪腹泻也取得较好的效果，同时增加了卵黄抗体作用的广谱性。胡子信等（1994）将引起仔猪严重发病的肠产毒素性大肠杆菌K88、K99、987P三个标准菌株，制成大肠杆菌三价菌苗，免疫接种健康产蛋鸡，制成鸡抗猪大肠杆菌高免卵黄液，并用以对仔猪大肠杆菌病进行预防和治疗，其有效率达到100%。李学伍（2000）等用分离纯化后的多价菌株的菌毛蛋白作为抗原，制备了抗仔猪大肠杆菌性腹泻的多价卵黄抗体。经试验证明，该多价卵黄抗体粉对发病仔猪的治愈率最高可达97.7%，比药物治疗的治愈率高21.2%。然而，华荣虹等（2002）比较K88、K99、987P、F41单一菌毛免疫与4种菌毛混合免疫母鸡的效果发现，菌毛单独免疫后卵黄抗体效价均高于混合菌毛苗免疫后相应卵黄抗体的效价。

在选择试验菌株时，大部分人选用标准菌株，也有一些研究者选用地方株。如Marquardt等（1999）采用地方株ETEC（K88+）菌毛抗原免疫母鸡后获得卵黄抗体，其对新生和断奶感染ETEC的仔猪不仅有保护作用，而且在商业性猪场用于提前断奶的仔猪也有效。他们的试验结果表明，用K88+
E.coli诱导而腹泻的3日龄仔猪，在用鸡蛋抗体后24h被治愈。而用未免疫母鸡蛋黄粉处理的，仔猪继续腹泻，其中62.5%因严重腹泻而死亡。在21日龄断奶仔猪的感染试验中，饲喂蛋黄抗体后有短暂的腹泻，试验期间100%存活且体重明显增加，而对照组则出现严重的腹泻和脱水症状，且48h内有仔猪死亡。对猪场14～18日龄的断奶仔猪的饲喂试验表明：饲喂含卵黄抗体日粮的仔猪在腹泻发生率和严重程度上均比饲喂含抗菌素的商品日粮组低。高云英等（2003）应用仔猪大肠杆菌标准菌株和地方分离菌株混合免疫商品蛋鸡，收获高免蛋制备多价卵黄抗体。经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察,对仔猪免疫保护率可达90%以上，攻毒保护率98%以上，临床治愈率95%以上。

3 利用基因工程技术制备菌毛抗原的研究

过去的研究中，ETEC 菌毛蛋白提取纯化方法已得到不断优化，而卵黄抗体的生产加工也已逐步工业化。本实验室在前期工作中也已经建立了快速准确的ETEC及其亚型的分子鉴定方法，并研制开发出预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体。然而，针对菌毛蛋白表达量少的问题，有必要进一步研究降低抗原生产成本的技术。

基因工程的本质就是按照人们的设计蓝图，将生物体内控制性状的基因进行优化重组，并使其稳定遗传和表达。基因工程技术利用细菌（如大肠杆菌和酵母菌等）基因表达调控机制相对简单和生长速度较快等特点，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生化物质。目前，已有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程均实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如富含半胱氨酸残基的血清白蛋白（HAS）、尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白等（张惠展，2002）。

国内外已有许多研究者在构建ETEC粘附素抗原的基因工程菌株方面开展了工作。Mooi FR等（1981）构建了含有K88ab抗原基因的重组质粒pFM205，进行转化，获得的重组菌株能与特异性抗K88ab的抗体结合。Dougan
等（1983）构建了含K88ac粘附素抗原的质粒pMF005，重组质粒依赖pBR322自身编码的启动子，能使K88ac粘附素抗原的表达水平升高。此外，这些研究者认为，若
pBR322启动子被编码色氨酸的启动子取而代之，那么当色氨酸启动子被阻遏时，重组质粒Trp-pMK005表达 K88ac粘附素抗原的水平提高（Kehoe
M等，1983）。后来，Dougan 等（1986）用免疫试验证明了含重组质粒pMK005的工程菌株具有较好的免疫活性，但对于如何解决K88粘附素抗原的高效表达没有进一步的研究。Holoda
E和Mikula I（1994）曾报道用Ptac 启动子代替质粒pBR322的P启动子，使K88ab抗原更易在受体菌中表达；且表达量高于K88ab野生型菌株，其中在受体菌E.coli
C600中表达量最高，同时在沙门氏伤寒菌TM333中的表达水平与E.coli C600相当（Holoda E和Mikula I，1995）。但对于构建后工程菌株粘附素蛋白表达的稳定性并未进行研究。

在国内，洪孟民等（1985）率先研制成ETEC K88工程菌；而张林元等（1985）用不同的受体菌也构建了不产生肠毒素的K88ac抗原工程菌株。同时，张景六等（1985）构建了带有K88和K99两种菌毛抗原基因的质粒，为预防不同菌毛抗原型ETEC引起的仔猪腹泻提供了更广泛的作用。而携带此质粒的工程菌株合成K99亚基和菌毛的能力略差于仅表达K99菌毛抗原的菌株。随后，李丰生等（1987）用基因工程技术构建了含ETEC
K88ac和LT（A-B+）两种抗原基因的菌株。此菌株的菌毛抗原的表达量与其亲本株基本相同。20世纪90年代，吴雅旭等（1991）用强启动子代替载体自身的启动子，结果获得了菌毛抗原表达效率为原株16倍的ETEC
K88ac抗原基因工程株。然而，研究者发现该重组子原代细胞于4℃放置数天，或连续传几代后，即使在氨卞青霉素抗性培养基上生长，表达水平也会明显降低。可见，其质粒不稳定，易丢失。针对这一缺陷的改进，将近十年国内都没有相关的研究报道。

可以预见，随着基因工程技术的进一步发展，以及新启动子的不断出现和DNA重组载体/受体系统的多样化，可以利用基因工程技术来构建高效、稳定表达ETEC菌毛蛋白的菌株，提高菌毛抗原的产量，从而大大降低卵黄抗体成本，促进这一替代抗生素新型添加剂的广泛应用。