1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 啤酒糟
取自湖北省啤酒学校啤酒厂。
1.1.2 木聚糖
美国sigma公司生产。
1.1.3 菌种
黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、假单胞菌均为湖北工学院再生资源利用课题组的保藏菌种。
1.1.4 斜面培养基
培养细菌：营养琼脂。
培养真菌：蔗糖20（g/l）、酵母膏10（g/l）、蛋白胨10（g/l）、琼脂20（g/l），pH值自然。
1.1.5 初筛培养基
培养真菌：木聚糖10（g/l）、K2HPO4 0.7（g/l）、KH2PO4 0.7（g/l）、MgSO4 0.7（g/l）、 NH4NO3 1.0（g/l）、NaCl 0.005（g/l）、MnSO4 0.001（g/l）、ZnSO4 0.002（g/l）、FeSO4 0.002（g/l）、琼脂20（g/l），pH值自然。
培养细菌：木聚糖10（g/l）， K2HPO4 2.0（g/l）、NH4NO3 2.0（g/l）、酵母膏5.0（g/l）、MgSO4 0.2（g/l）、琼脂20（g/l），pH值7.2。
1.1.6 复筛培养基
啤酒糟：麸皮＝8：2；添加培养基干料1%的NH4NO3。
1.2 方法
1.2.1 菌种的活化
将菌种接入斜面培养基中，置适温（细菌 37℃；真菌 30℃）下培养48～72h。
1.2.2 出发菌株的筛选
将保藏的斜面菌种经活化、分离纯化后，点植于初筛平板培养基上，分别置适宜温度条件下培养40～48h，测定菌落直径和透明圈直径，计算HC值。HC值＝透明圈直径/菌落直径，将HC值大的菌株（真菌），作为出发菌株，接入复筛培养基中，置30℃下培养后测酶活力。
1.2.3 菌种的诱变
1.2.3.1 诱变剂
①紫外线：30W紫外灯管，距离30cm，紫外灯预先开30min，以稳定光源。②LiCl：将20%LiCl溶液定量加入无菌平皿中，与培养基混匀制成LiCl平板。
1.2.3.2 诱变处理方法
（1） 单孢子悬浮液的制备
用无菌水洗下出发菌株的斜面孢子，置摇床上150r/min振荡分散30min，经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为106个/ml的单孢子悬浮液。
（2） 诱变剂处理
①LiCl处理：将孢子悬浮液稀释后涂于LiCl平板上。②紫外线处理：预热紫外灯30min后，取浓度为106~107个/ml的孢子悬液，注入Ф9cm的无菌培养皿中（5ml/皿），置紫外灯下照射处理一定时间。
1.2.4 突变菌株的分离筛选
1.2.4.1 初筛
将经诱变处理过的孢子悬浮液适当稀释后涂布于初筛平板上，30℃恒温培养48h后，计算存活率并挑取透明圈较大的变异菌株接入斜面培养基。
存活率（%）＝诱变处理后的存活菌数/未诱变处理的活菌数×100%
1.2.4.2 复筛
将突变菌株接入复筛培养基中，30℃条件下培养64～68h，得到固态发酵培养物，测定其酶活力。
1.2.5 酶活力测定
1.2.5.1 酶液的制备
称取固态发酵培养物5g,加入自来水100ml，在40℃下浸提1h，过滤，滤液即为酶液。
1.2.5.2 木聚糖酶活力测定[4]
取0.1ml适当稀释的粗酶液和用pH值4.6醋酸缓冲液配制的1%木聚糖悬浮液0.9ml置于试管中，40℃水浴保温10min后加入2.0ml DNS试剂，沸水浴3min。用3，5二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）测定还原糖（以木糖计），以100℃灭活粗酶液作对照。酶活力单位定义为：每分钟水解木聚糖形成相当于1μmol木糖的还原糖所需的酶量（IU/g）。
木聚糖酶活单位＝NG/150.13/0.1×10/干曲重〔μmol木糖/（g干曲·min·40℃）〕
式中：N——酶液稀释倍数；
G——酶解液中木糖的含量（μg）；
150.13——木糖分子量；
0.1——加酶量（ml）；
10——酶解时间（min）。
2 结果与分析
2.1 出发菌株的筛选
据文献[5-8]报道，黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉等真菌和嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、假单胞菌等细菌中的某些菌种可产木聚糖酶。故而从课题组所保藏的菌种中挑出这些真菌和细菌，试图从中筛选木聚糖酶高产菌株。
以木聚糖为唯一碳源的平板培养基培养菌株。从40株保藏菌株中得到15株生长快，HC值＞1.2的菌株（米曲霉和黑曲霉），将其接入复筛培养基中进行固态发酵培养，测定木聚糖酶活力，结果见表1。
由表1比较可见：①HC值与固态发酵酶活力并不一定呈正相关，这可能与培养基质等培养条件改变有关，也与不同菌株所具有的木聚糖酶的酶学性质不一致有关；②An27的酶活力明显高于其它菌株，在复筛培养基中培养65h酶活可达216.611 IU/g。因而选An27作为出发菌株。
2.2 产酶菌株的诱变
为了进一步提高菌株的产酶能力，采用紫外线、LiCl分别对An27进行诱变处理。诱变处理量孢子存活的关系见图1，图2。
由图1、图2可见，随着诱变处理量的增加致死率提高，存活率下降。
2.3 突变株的筛选
从初筛平板上挑取透明圈较大的菌株进行斜面传代接种，固态发酵复筛，结果见图3。
由图3可见，1～4号菌株的木聚糖酶活力较高。
2.4 突变株的传代稳定性试验
将筛选出的4株菌进行多次斜面传代接种，并于斜面传代接种后，接种于复筛培养基中固态发酵培养，测各菌株的木聚糖酶活（见表2）。
综合比较表2中数据，可见An27-3不仅木聚糖酶活力较高，而且产酶性能较稳定。
3 小结
将从保藏菌种中筛选的黑曲霉An27作为出发菌株进行诱变育种处理，再从突变菌株中筛选到一株能发酵啤酒糟高产木聚糖酶的菌株——An27-3。
在以啤酒糟为主要原料的固体基质上，30℃条件下培养64～68h, 黑曲霉An27的木聚糖酶活为每克干曲216.611 IU，而黑曲霉An27-3的酶活为每克干曲283.362IU，比出发菌株提高30.82%。经传代试验证明An27-3的产酶性状较稳定。通过进一步优化其发酵条件可在饲用酶制剂生产中有良好的应用前景。
饲料工业
