饲料中胰蛋白酶抑制剂铁研究状况

１  胰蛋白酶抑制剂的来源

　　胰蛋白酶抑制剂广泛存在于豆类、谷类、油料作物等植物中。胰蛋白酶抑制剂在这些作物在各部位均有分布，但主要存在于作物的种子中。在种子内，胰蛋白酶抑制剂主要分布于蛋白质含量丰富的组织或器官，定位于蛋白体、液泡或存在于细胞液中。例如大豆和绿豆种子中胰蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的6%～8%。在不同作物种子中，胰蛋白酶抑制剂铁活性各不相同。通常以大豆中胰蛋白酶抑制活性最高。

　　在禽类的蛋清中存在两种蛋白酶抑制剂――卵类粘蛋白和卵清蛋白酶抑制。卵类粘蛋白可抑制猪、羊和牛的胰蛋白酶的活性，但对人的胰蛋白酶活性无抑制作用。卵清蛋白酶抑制剂可抑制牛和羊的胰蛋白酶及糜蛋折酶的活性。它们的存在可以防止蛋白质的分解，阻止细菌在蛋中繁殖，因而具有保护蛋黄和卵胚的作用。它们也是摄食生禽蛋后不易消化和易引起腹泻的原因。

２  胰蛋白酶抑制剂的生物化学性质

2.1  大豆胰蛋白酶抑制剂的分子量较小（通常低于50 000）的、具有生理活性的功能性蛋白质。目前研究得最多的是大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor,STI），它根据氨基酸序列同源性可分为以下两类：

2.1.1  Kunitz类抑制剂（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）

   此类抑制剂由Kunitz（1945）首次从大豆中分离并结晶出来,因此而命名。这类抑制的分子量为20 000～25 000，由181个氨基酸和２个二硫键组成，活性中心（即直接参与和胰蛋白酶相互作用的部位）位于第63个氨基酸（精氨酸）和第64个氨基酸（异亮氨酸）之间。由于分子内只有一个活性中心，因而又被叫做单头（single-headed）抑制剂，主要对胰蛋白酶直接地、专一地起作用。这类抑制剂与胰蛋白酶的结合是定量地进行的，即１g分子（mol）的抑制剂可以结合lg分子(mol)的胰蛋白酶.

2.1.2  Bowman-Birk类抑制剂(Bowman-Birk in-hibitor,BBI)

　　此类抑制剂是因为Bowman(1994)首先从大豆中分离并由Birk(1961)鉴定而得名.这类抑制剂的分子量为6000～10000，由71个氨基酸组成,含有7个二硫键。它有两个活性中心，分别位于第16个氨基酸(赖氨酸)和第43个氨基酸(亮氨酸)与第44个氨基酸(丝氨酸)之间,可分别与胰蛋白酸和糜蛋白酶结合。由于抑制剂分子内有两个活性中心，故被称为双头（double-headeb）抑制剂。

　　Kunitz类和Bowman-Birk类抑制剂是大豆中最主要的两类胰蛋白酶抑制剂，它们在大豆中的含量分别为1.4%和0.6%。这两类胰蛋白酶抑制剂对热、酸、碱的稳定性有所差异。纯化的Kunitz类抑制剂在30℃以下温度和pH值1～2范围内保持其活性。在80℃短时间加热能使它可逆地变性，而在90℃加热则使它不可逆地失活。Bowman-Birk类抑制剂比Kunitz类抑制剂对热、酸、碱的稳定性强。当在干燥状态、105℃加热或用其0.02%水溶液在100℃加热10min,仍可保存它们的活性(Fennema ,1980).关于它们对热的稳定性也右相反的报道,认为BBI比KTI对热更不稳定(Dipietro和Liener,1989)。

2.2  胰蛋白酶抑制剂与靶酶的反应机理

　　大豆中的胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂.它可以和胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)发生反应。胰蛋白酶抑制剂与其靶酶的相互作用，通常如酶与底物之间的相互作用一样，属于互补型作用机理。两者反应时，抑制剂暴露在外的活性中心与靶酶的活性中心通过氢键相连接，形成稳定的共价型复合物，从而导致酶活性中心的闭锁，使靶酶的活性丧失。两者之间的反应用化学方程式表示为：

　　蛋白酶+抑制剂=蛋白酶与抑制剂复合物=蛋白酶+变性的抑制剂(Laskowski等，1980；Gueguen等,1993)

　　与通常的酶催化反应相比,蛋白酶与抑制剂之间反应的米氏常数(Km)很低,故蛋白酶与抑制剂的亲和力大,二者可以迅速结合形成复合物.与一般酶的底物不同,抑制剂与酶结合形成复合物.与一般酶的底物不同,抑制剂与酶结合后期活性中心的肽键并不裂解或裂解速度极慢。因此，该复合物虽然可以分       解成游离的酶和变性或未变性的抑制剂，但解离速度非常缓慢。

　　以上说明抑制剂从某种意义上讲可看作是酶的底物（作用物），其与酶的接触部位主要集中于抑制剂活性中心（反应位点）附近的氨基酸残基。Sweet等（1974）和Laskowski等(1971)分别列出了大豆KTI和BBI活性中心附近的氨基酸序列(表1)

表1　大豆胰蛋白酶抑制剂反应位点(↓)附近的氨基酸序列

注：1．Sweet等,1974;

2．Laskowski等，1971

３  胰蛋白酶抑制剂的有害作用

　　胰蛋白酶抑制剂对动物的有害作用主要是引起生长抑制和使某些动物引起胰腺肥大。胰蛋白酶抑制剂对动物生长产生抑制作用，一般认为有以下两方面的原因：

3.1  胰蛋白酶抑制剂能和小肠中的胰蛋白酶及糜蛋白酶结合,形成稳定的复合物,使酶失活,导致食物蛋白质的消化率降低,引起外源性氮的损失.

3.2  胰蛋白酶抑制剂可引起胰腺分泌活动增强,导致胰蛋白酶和糜蛋白酶的过度分泌.由于这些蛋白酶含有非常丰富的含硫氨基酸,所以使用于合成体组织蛋白的这些氨基酸转而用于合成蛋白酶,并与抑制剂形成复合物而最终通过粪便排出体外,从而导致内源性氮和机体含硫氨基酸的大量损失.大豆蛋白质本来就缺乏含硫氨基酸,加上抑制剂所引起的含硫氨基酸的额外损失,导致体内氨基酸代谢不平衡,因而阻碍了动物的生长.有研究认为,摄入含有蛋白酶抑制剂的日粮时,通过含硫氨基酸的内源性损失对机体氮平衡的影响,比通过日粮中氨基酸的损失(外源性损失)所致的影响要大(Barth等,1994).

　　关于胰蛋白酶抑制剂引起含硫氨基酸内源性损失的机理,一般认为,胰腺体细胞分泌蛋白泉水解酶原(包括胰蛋白酶原、糜蛋白酶原等)是受胆囊收缩素－促胰酶素（Cholecystokinin-pancreozymin，缩写CCK-PZ）调节的。CCK-PZ是十二指肠和空肠粘膜的内分泌细胞(Ⅰ细胞)分泌的一种肽类激素。CCK-PZ的分泌和小肠中胰蛋白酶及糜蛋白酶的数量之间存在负反馈性调节机制。当小肠中胰蛋白酶及糜蛋白酶和食入的胰蛋白酶抑制剂结合后，在肠道内酶的含量降到一定程度时，CCK-PZ的分泌即增加，从而剌激胰腺分泌更多的胰蛋白酶原和糜蛋白酶原至肠道中。由于这些酶的大量分泌，因而造成体内含硫氨基酸的内源性损失。

　　胰蛋白酶抑制剂引起动物胰腺肥大的机理至今尚未完全弄清。一般认为，由于CCK-PZ的分泌增加,因而促使胰腺的分泌过度增加,使胰腺外分泌组织细胞的体积增加和数量增多,从而引起胰腺代偿性并未相起胰腺肥大(Schneeman，1986)。有人认为，不同种类动物胰腺的相对重量与它们对胰蛋白酶抑制剂反应的敏感性的相对似乎有直接关系。据报道，胰腺的重量超过体重0.3%的动物(如猪、犊牛)则不出现胰腺肥大（表２）

表2　不同动物胰腺相对重量与大豆TI引起的胰腺肥大效应间的关系

　　大豆胰蛋白酶抑制剂对人体胰蛋白酶的抑制作用，报道较少。一般认为它对人体胰蛋白酶活性只有部分抑制作用。Krogdahl和Holm（1981）指出,人食入大豆后,在胃液中KTI即被灭活,但BBI仍能保持其活力.

　　关于胰蛋白酶抑制剂对动物的致癌性与抗癌作用问题,目前报道结果不一。有人报道，某些动物胰腺瘤的发生与日粮中胰蛋白酶抑制剂的活性呈正相关（Morgan等，1977；Gumbmann 等，1989）。但有一些研究抑制剂甚至有降低癌症发生率的作用（Liener 和Hasdai,1986;Messia和Ende,1995）。

　　关于反刍动物瘤中微生物能否消除豆类中胰蛋白酶抑制剂的活性，报道结果不一致。有试验表明，大豆KTI在瘤胃内可很快地被瘤胃微生物降解而失活（Baintner，1981）。Holmes等(1993)报道，在绵羊瘤胃液中加入７种粉碎的豆类作物， 12h～18h后，胰蛋白酶抑制剂的活性仍无明显变化。

　　此外，近年研究还发现豆类植物种子的胰蛋白酶抑制剂也是α－淀粉酶的抑制剂(Hudson,1984) 。

４  饲料中胰蛋白酶抑制剂的去除

4.1　 热处理法

　　胰蛋白酶抑制剂本身为蛋白质或蛋白质的结合体,对热不稳定,充分加热可使之变性失活,从而消除其有害作用。胰蛋白酶抑制剂受加热处理而失活的程度与加热的温度、时间、饲料粒度大小和水分含量等因素有关。

　　用预榨浸出去、压榨法生产的大豆饼粕，由于在加工过程中有较充分的加热，可使胰蛋白酶抑制剂失活，有害作用大大减弱或消除。溶剂浸提法或一些土法、冷榨法生产的大豆饼粕，由于加热不充分，其中仍含有相当量的胰蛋白酶抑制剂，其营养价值大为降低，因而用于鸡和猪的饲料时还应经过加热钝化处理。

　　生大豆中胰蛋白酶的含量高，用于猪、鸡饲粮时应先进行加热处理。生大豆对反刍动物虽无不良影响，但用加热处理过的大豆饲喂反刍动物时，可提高其产乳量和生长率。

　　大豆及生豆粕的加热处理方法有煮、蒸汽处理（常压或高压蒸汽）、烘烤、红外辐射处理、微波辐射处理、挤压膨化（干法或湿法挤压膨化）等。湿法加热（蒸汽、煮等）的效果一般优于干法加热（烘烤、红外辐射等）。通常采用常压蒸汽加热30min，或98kPa压力的蒸汽处理15min～20min，可使胰蛋白酶抑制剂失活。此外，挤奈膨化的效果也比较好。

　　大豆及豆粕的加热程度对其营养品质影响很大。加热不足，胰蛋白酶抑制剂破坏不充分，降低蛋白质的消化率；加热过度，虽然胰蛋白酶抑制剂已失活，但分使蛋白质发生变性，溶解度降低，特别是引起赖氨酸、精氨酸和胱氨酸的破坏或消化率降低。

　　为了评价大豆及豆粕加热的程度，从而判断大豆与豆粕中胰蛋白酶抑制剂的破坏程度及其营养价值，可采用多种评价方法与指标，如胰蛋白酶抑制剂活性（trypsin inhibitor activity,TIA）、尿素酶活性（urease activity,UA）、蛋白质溶解度（protein solubility, PS）等。这几项指标之间存在着明显的正相关关系，因此测定其中任何一项均可。由于胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法较为复杂，故一般不常用。通常多测定尿素酶活性和蛋白质溶解度。

　　大豆及豆粕中存在的胰蛋白酶抑制剂和尿素酶的本质都是水溶性蛋白质，它们经加热处理时会失去活性。尿素酶经加热而失活的速率与胰蛋白酶抑制剂大致相同，且尿素酶活性测定方法简便，因此生产实践中通常采用尿素酶活性的测定来反映大豆及豆粕加热是否足够的指标。尿素酶活性高，表明大豆或豆粕加热不足，其中胰蛋白酶抑制剂的活性高；尿素酶活性低，表明加热充分，其所含的蛋白酶抑制剂已大多被灭活。大豆及豆粕中尿素酶活性应处于合适的范围，基允许量标准，不同国家和地区的规定不尽一致，而且由于测定方法的不同，允许量的数值及表示单位也有所不同。我国制定的《大豆制品中尿素酶活性测定方法》标准（GB8622-88）是以每分钟每克大豆制品释放的氨态氮的毫克数(Nmg/g·min)来表示尿素酶活性。我国《饲料用大豆》标准（GB10384-89）规定：“饲料用大豆需加热后使用，尿素酶活性不得超过0.4”。我国《饲料用大豆饼》标准（GB10379-89）和《饲料用大豆粕》标准（GB10380-89）规定,大豆饼和大豆粕的尿素酶活性都不得超过0.4。但在生产实践中，人们通常采用pH增值法测定尿素酶活性。该法是以pH值的上升值(△pH)来表示尿素酶活性。一般认为，饲料用大豆饼、粕和加热后的饲料用大豆，其尿素酶活性的最适范围为0.05～0.20△pH，最高不超过0.5△pH。但不同国家和地区的标准略有差异。如美国大豆粕质量标准中，尿素酶活性规定为0.05～0.20△pH；巴西为0.01～0.3△pH；多数国家规定为0.05～0.5△pH。台湾省标准为0.02～0.3△pH。

　　蛋白质溶解度（PS）一般作为判定大豆及豆粕是否加热过度的指标,即当尿素酶活性因过度加热而降为0时,用蛋白质溶解度仍可评价过度加热的豆粕的品质。大豆加热温度的升高和时间的延长，大豆蛋白会不同程度地发生变性，其溶解度降低。因此，通过测定大豆及豆粕的蛋白质溶解度。可反映出热处理过程中大豆蛋白的性程度。如果加工过程中热处理温度太高或时间延长，大部分蛋白质发生变性，溶解度降低，表明大豆及豆粕的营养价值下降。一般要求蛋白质溶解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85%时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度(Dale,1990)。

4.2  化学处理法

　　一些研究表明,大豆中的胰蛋白酶抑制剂可以通过化学处理方法使其灭活。此类方法的作用机理一般都是利用化学物质破坏胰蛋白抑制剂的二硫键，从而改变胰蛋白酶抑制剂分子结构以达到灭活的目的。已采用过的化学物质（或称化学钝化剂）有亚硫酸钠（Na₂SO₃）、偏重亚硫酸钠（Na₂S₅O₃）、硫酸铜、硫酸亚铁、硫代硫酸钠、戊二醛以及一些带硫醇基的化合物（胱氨酸、N-乙酰胱氨酸）等。候水生等（1994）报道,采用0.5%偏重亚硫酸钠（Na₂S₂O₅）、处理生豆粕1周以上,可使胰蛋白酶抑制剂降低59.83%。

4.3 酶处理法

　　国外有人研究用某些真菌和细菌的菌株所产的特异性酶来来活大豆中的胰蛋白酶抑制剂,有一定的效果(Meijer和Spekking，1993;Huo等,1993)。国内近年有人用枯草杆菌蛋白酶对脱脂大豆粉进行水解，结果表明枯草杆菌蛋白酶可以水解去除脱脂大豆粉中所含的胰蛋白酶抑制剂，但存在的总是是同时将大豆中其它蛋白质也进行了水解（陈中等，2000）因此，用外源酶制剂来灭活大豆等豆类籽实中的胰蛋白酶抑制剂的处理方法目前仍处于研究阶段，尚未应用于生产，但它是一个有前途的方法。

4.4  作物育种方法

　　国内外对大豆Ti基因(不含胰蛋白酶抑制剂的隐性基因)及其遗传规律的研究,为通过作物育种手段降低大豆胰蛋白酶抑制剂的活性提供了依据。Hymowitz于1986年已成功地培育出了低胰蛋白酶抑制剂的大豆新品种,其胰蛋白酶抑剂的活性比一般大豆低50%。