摘 要 本试验利用体外酶学试验法研究了氨基酸螯合铁对ALA合成酶活力的影响。试验结果表明：① 当酶反应体系中血红素浓度为5×10-5mol/L时，对ALA合成酶有抑制作用。② 不同铁源对ALA合成酶的活性有促进作用，而且不同铁源对ALA合成酶活性的影响程度不同，甘氨酸和硫酸亚铁混合物组 > 硫酸亚铁组 > 赖氨酸和硫酸亚铁混合物组 > 赖氨酸螯合铁组 > 甘氨酸螯合铁组。
关键词 血红素，硫酸亚铁，赖氨酸螯合铁，甘氨酸螯合铁，
合成对血红素代谢的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血红素合成酶系中的限速酶（顾天爵 1988）。研究表明血红素对此酶有反馈抑制作用。在一般情况下，血红素合成后，迅速与珠蛋白结合形成血红蛋白，不致有过多的血红素堆积，对ALA合成酶不引起反馈抑制。如果血红素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，过多的血红素可氧化成高铁血红素。研究表明，当亚铁血红素的浓度为10-6mol/L时可抑制ALA合成酶的合成，为10-5~-4mol/L时可抑制ALA合成酶的活性（血红素的生理正常值为10-7~-6mol/L），而高铁血红素则是 ALA合成酶的强烈抑制剂。由于ALA合成酶受血红素含量（终产物的浓度）的调控，故根据生物化学的反馈抑制理论，提出一个假说：细胞内若有氨基酸螯合物铁存在，螯合物的结构与血红素相似，作为竞争性类似物，可能与ALA合成酶的控制中心结合，竞争结合调控位点，而这种结合只能是“类似”的，这种类似性不影响酶活力的变化，从而使 ALA合成酶能在“较多”血红素存在时，仍有活性。基于以上理论和前几个试验的结果，设计了本试验，拟通过体外酶学试验，研究氨基酸螯合铁对ALA合成酶活力的影响，推测氨基酸螯合铁对血红素合成的影响，为上述假说提供论据。
1 试验用试剂和仪器 ATP、磷酸吡哆醛、还原型谷胱甘肽、ALA标准物和血红素由Sigma公司购入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃时，10U/mg）由德国 Boehringer Mannheim公司购入。蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、对－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、过氯酸、二氯化汞、浓盐酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、无水硫酸钠等均为国产，产品等级为分析纯试剂。 甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁为试验室制备品。玻璃匀浆器、HZS-H恒温水浴振荡箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷冻离心机、日本岛津UV-2401PC型紫外分光光度计。
2 试验实施的技术路线
2.1 线粒体的分离制备匀浆介质：称取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于约800ml蒸馏水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸馏水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，备用。具体操作：取新鲜猪肝脏，用预冷（0℃）的匀浆介质洗净，再用滤纸吸干表面水分，称重。将肝用剪刀剪碎，按每克肝脏组织加8ml匀浆介质，加入到玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆。待肝脏破碎后，移出到离心管中，在冷冻离心机上4 409×g离心15min，吸取上清液。上清液再在冷冻离心机上13 675×g离心30min，弃去上清液，余下的是线粒体部分。用匀浆介质洗涤四次，冻存。将来用时，经数次交替冻溶，使线粒体破碎，以此作为粗酶液。
2.2 反应条件的确定主要方法参考Wider（1971）。取2ml反应液于试管中，2ml反应液组成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol还原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl缓冲液（pH=7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精确数量的粗酶液。37℃保温30分钟，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，终止反应。取样分析ALA含量，如有ALA合成，说明上述反应条件适用，否则加以修改。
2.3 影响ALA合成酶的因素的确定（试验设计）在2.2的基础上，按下列计划，加入可能影响ALA合成酶活性的物质，然后测定ALA的生成量，以研究ALA合成 酶活性的变化情况。甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁、甘氨酸与硫酸亚铁的混合物、赖氨酸与硫酸亚铁的混合物、硫酸亚铁,以上为同一浓度；亚铁血红素，分别为高和低两个浓度。根据血红素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性时的浓度，本试验设定高血红素浓度为5×10-5 mol/L，低血红素浓度为5×10-7mol/L；甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁、甘氨酸与硫酸亚铁的混合物、赖氨酸与硫酸亚铁的混合物、硫酸亚铁的浓度均设为5×10-5 mol/L（以铁计）。
2.4 ALA生成量的测定采用的测定方法的原理为：ALA与乙酰乙酸乙酯在pH6.8及100℃的条件下作用生成吡咯衍生物，再与对—二甲氨基苯甲酸反应，生成红色化合物，用氯仿提取，比色定量。
2.5 酶活的表示方法 以单位时间内产生ALA的量为一个ALA合成酶活力单位（U）。
2.6 数据处理和分析试验所得数据用SAS（6.12版本）软件中的GLM过程进行方差分析和多重比较。图形制作采用Microsoft Excel。
3 结果与分析试验结果见表1和图1，不同铁源对ALA合成酶活性的影响不同。硫酸亚铁组和甘氨酸与硫酸亚铁混合物组间差异不显著（p>0.05），极显著高于其它处理组（p<0.01），赖氨酸与硫酸亚铁混合物组、赖氨酸螯合铁组、甘氨酸螯合铁和低血红素组间差异不显著（p>0.05），但显著高于高血红素组（p<0.05）。尽管低血红素组与高血红素组间在统计上差异不显著（p>0.05），但从具体测值看，低血红素组明显高于高血红素组。
4 讨论反馈抑制是指反应系统中最终产物对反应中关键酶活力的抑制作用，是生物体内快速调节酶活力的重要方式之一。生物体内一系列代谢反应的结果，逐渐造成了最终产物的积累，从而使反应速度减慢，甚至停止，当最终产物被消耗或转移而使浓度降低时，又逐渐形成有利于反应进行的环境，如此不断地调节，犹如恒温控制一样。此时称这种酶为变构酶，称最终产物为变构抑制剂。有研究者用部分纯化了的哺乳动物肝中的ALA合成酶研究发现，当血红素的浓度为5×10-5 mol/L时(血红素的生理正常值为10-7~10-6 mol/L)，可直接抑制ALA合成酶的活性，可见，血红素对ALA合成酶有反馈抑制作用（欧阳培，1989）。关于反馈抑制作用机制的研究表明，在酶反应体系中添加诱导物，诱导物与变构酶的控制中心结合，这种结合既不影响酶的活性，又能阻止最终产物与变构酶结合,从而使酶的活性增加。那么，氨基酸螯合铁的结构与血红素非常相似，在血红素合成反应中加入氨基酸螯合铁，能否起到诱导物的作用？
尽管当酶反应体系中血红素浓度为5×10-5 mol/L时（高血红素组）测得的ALA合成酶的活性比血红素浓度为5×10-7 mol/L（低血红素组）时的测值低13.32%，但在统计上，高血红素组和低血红素组的测值间差异不显著，这主要因为统计样本量低（n=2）所致。本试验结果说明高血红素组中血红素对ALA合成酶有抑制作用，这与前人的研究结果一致（欧阳培，1989）。向反应体系中分别加入甘氨酸和硫酸亚铁的混合物或硫酸亚铁（浓度为5×10-5 mol/L）后，测得的ALA合成酶的活性极显著高于低血红素组的测值，分别比低血红素组高66.01%和57.70%，说明反应体系中加入甘氨酸和硫酸亚铁的混合物或硫酸亚铁对ALA合成酶有促进作用。尽管向反应体系分别加入其它铁源（赖氨酸和硫酸亚铁混合物、甘氨酸螯合铁和赖氨酸螯合铁）后，ALA合成酶的活性与低血红素组的测值间差异不显著，但从具体测值看，几种铁源的加入不同程度地提高了ALA合成酶的活性（赖氨酸和硫酸亚铁混合物组， 10.54%；赖氨酸螯合铁组，6.39%；甘氨酸螯合铁组，3.65%）。Wider（1971）用大豆细胞的研究表明，向酶反应体系中加入Fe2+，可增强ALA合成酶的活性。Vogel（1960）用取自缺铁鸭的血液的研究表明，向体外酶反应体系中加入Fe2+能加强缺铁细胞合成血红素的能力，同时，他还发现，向反应体系中同时加入Fe2+和甘氨酸，对血红素合成的促进作用比单独加甘氨酸或铁更强。本试验得到结果与他们的结果基本一致。比较分别加入各种铁源后的各酶反应体系，不难找出其中的区别。由2.2可见，酶反应体系中含有甘氨酸（作为原料参加反应），加入硫酸亚铁后，整个反应体系与加入甘氨酸和硫酸亚铁混合物组类似。酶反应体系的pH值为7.2，这样的pH值极有利于形成氨基酸螯合铁，由此可以推测酶反应体系中形成了络阳离子型甘氨酸螯合铁。甘氨酸螯合铁的化学结构与血红素中卟啉环上的吡咯极为相似。甘氨酸螯合铁作为竞争性类似物，可能与ALA合成酶的控制中心结合，竞争结合调控位点，从而对ALA合成酶的活性有影响。赖氨酸螯合铁由于有侧链，化学结构与血红素中卟啉环上的吡咯有些差别，可能不会产生上述作用，本试验得到的结果也支持这一点。由于赖氨酸螯合铁和甘氨酸螯合铁的稳定常数相近，向酶反应体系中加入赖氨酸和硫酸亚铁混合物后，两种螯合铁都可能形成，但由试验结果可见，赖氨酸螯合铁和甘氨酸螯合铁共存时对ALA合成酶的影响不如只有甘氨酸螯合铁时大。是由于当Fe2+、赖氨酸和甘氨酸共存时形成了更为复杂的化合物还是其它原因有待于进一步试验确定。
由试验结果可见，向反应体系中分别加入赖氨酸螯合铁和甘氨酸螯合铁（内络盐型）对ALA合成酶的活性也有影响，但不如前三种铁源的强，主要由于在pH值为7.2的溶液（本试验的反应体系）中，氨基酸螯合铁（内络盐型）的溶解度较低，这与第一章和第二章得到的结果并不矛盾，因为在小肠液中，氨基酸螯合铁的溶解度得到大幅度提高（廖益平，1999）。
本试验得到的结果只能为前面的假说的成立（细胞内若有氨基酸铁螯合物存在，螯合物的结构与血红素相似，作为竞争性类似物，可能与ALA合成酶的控制中心结合，而这种结合只能是“类似”的，这种类似性不影响酶活力的变化，从而使ALA合成酶能在“较多”血红素存在时，仍有活性）提供一个有力的证据，要想证明假说的正确性，必须进行更深入的生化研究。
5 结论
（1）当酶反应体系中血红素浓度为5×10-5 mol/L时，对ALA合成酶有抑制作用。
（2）不同铁源对ALA合成酶的活性有促进作用，而且不同铁源对ALA合成酶活性的影响程度不同，甘氨酸和硫酸亚铁混合物组>硫酸亚铁组>赖氨酸和硫酸亚铁混合物组>赖氨酸螯合铁组>甘氨酸螯合铁组。
