葡萄糖氧化酶(ＧｌｕｃｏｓｅＯｘｉｄａｓｅ,简称ＧＯＤ)是一种需氧脱氢酶,能专一地氧化β-Ｄ-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。1928年Ｍｕｌｌｅｒ首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。1960年Ｋｕｓａｉ等、1964年Ｐａｚｕｒ和Ｓｗｏｂｏｄ-ｄａ分别从青霉素和黑曲霉中提纯葡萄糖氧化酶。1995年,Ｐｅｔｒｕｃｃｉｏｌｉ等用青霉素的突变株生产出葡萄糖氧化酶。我国自1986年开始研究葡萄糖氧化酶的制备提纯工艺,1998年正式投入生产,1999年农业部将其定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一。
1 葡萄糖氧化酶的理化性质
高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末,易溶于水,不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂,50%丙酮、60%甲醇能使其沉淀。一般制品中均含有氧化氢酶,酶的最大光吸收波长为377～455ｎｍ。在紫外光下无荧光,但在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。固体葡萄糖氧化酶制剂在0℃下保存至少稳定2年,在-15℃下则可稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的ｐＨ值范围为3～4,最适ｐＨ值为5,如果没有葡萄糖等保护剂的存在,ｐＨ值大于8或小于3葡萄糖氧化酶将迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度为30～60℃,该酶不受乙二胺四乙酸、氰化钾及氟化钠抑制,但受氯化汞、氯化银、对氯汞苯甲酸和苯肼抑制。
2 葡萄糖氧化酶在饲料行业中的应用
作为国家允许使用的饲料酶制剂之一,葡萄糖氧化酶在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛应用。葡萄糖氧化酶是一种新型的酶制剂,能够改善动物肠道环境,调节饲粮消化,促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物(ＬＰＯ)和乳铁蛋白的混合饲料添加剂,可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻,并有促进动物生长作用。加有葡萄糖氧化酶的青贮饲料对长膘的牛有利,其原因是葡萄糖氧化酶可以消耗青贮的氧气,提高青贮内的缺氧程度,有利于厌氧性乳酸菌的增殖,加快了乳酸菌的发酵过程,迅速产生大量乳酸,使青贮的ｐＨ值很快下降,抑制了有害细菌的繁殖,避免了异常发酵,最终保证青贮质量。
3 葡萄糖氧化酶促生长的作用机理
3.1 消除肠道病原菌生存环境
保持肠道菌群生态平衡 葡萄糖氧化酶能催化肠道内的葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢,当过氧化氢积累到一定浓度时,直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌的生长繁殖。其作用机理完全不同于抗生素,不会产生菌体抗药性或药物残留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除肠道内氧气,为厌氧有益菌双歧杆菌的增殖制造厌氧环境;生成的葡萄糖酸可降低胃肠内ｐＨ值为乳酸菌生长制造酸性环境。有益菌大量增殖形成微生态竞争优势,不利于大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌存活,控制感染,排除腐败物质,提高巨噬细胞活性,从而提高机体免疫力。
3.2 保护肠道上皮细胞完整
肠道上皮细胞保持高度的物理完整,可以阻挡大量病原体的侵入。畜禽处于应激状态时,过多有氧化作用的“自由基”会破坏肠道上皮细胞,而葡萄糖氧化酶具有氧化作用,能清除自由基,保护肠道上皮细胞完整。
3.3 改善肠道酸性消化环境 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸,在肠道内发挥酸化剂的作用,创造酸性环境;降低胃中的ｐＨ值,激活胃蛋白酶,促进矿物质和维生素Ａ、Ｄ的吸收,并且酸性肠道环境可减少有害菌繁殖,预防腹泻。葡萄糖氧化酶还能同时改善饲料的适口性,在动物出现拒食、厌食、消化不良、腹泻时,添加葡萄糖氧化酶可以使动物迅速恢复正常采食。
3.4 解除肠道霉菌毒素中毒
葡萄糖氧化酶直接抑制黄曲霉、黑根霉、青霉等多种霉菌,对黄曲霉毒素Ｂ1中毒症有很好的预防效果。高温季节,饲料发霉产生的毒素会使动物肝肿大、胸腺萎缩、巨噬细胞受到毒害,进而导致免疫抑制。添加葡萄糖氧化酶则可防治这些症状。
4 葡萄糖氧化酶的制备提纯方法
发酵法生产柠檬酸和葡萄糖酸的废菌丝富含葡萄糖氧化酶,是工业生产葡萄糖氧化酶的理想资源。对工业废菌丝的处理还可以减轻由其造成的环境污染。有研究表明,用葡萄糖酸发酵的工业废菌丝生产葡萄糖氧化酶,通过有机溶剂沉淀聚乙二醇二次沉淀、羟基磷灰石柱色谱分离,可得到比活性超过190Ｕ/ｍｇ蛋白的产品-葡萄糖氧化酶。由于黑曲霉或青霉在产生葡萄糖氧化酶的同时还常伴有过氧化氢酶(主要)、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白质的产生,因此有必要首先对葡萄糖氧化酶进行提纯,以除去杂蛋白。常用纯化方法如下:
4.1 沉淀法
选择适宜沉淀剂浓度通过分级沉淀或一步沉淀可将葡萄糖氧化酶和其他蛋白质初步分开。沉淀操作需在低温下进行,因为葡萄糖氧化酶在室温下对某些沉淀剂不稳定易失活。
4.2 吸附法
吸附材料的吸附机理是在一定条件下,吸附材料的活性基团与葡萄糖氧化酶通过疏水相互作用而被吸附,然后通过改变缓冲液的浓度和ｐＨ值而改变吸附材料中活性基团的电离状态使葡萄糖氧化酶与吸附剂解吸。
4.3 离子交换法
葡萄糖氧化酶的等电点在4 9左右,而过氧化氢酶的等电点在6 5附近。因此在提纯葡萄糖氧化酶时应选用阴离子交换剂,且在ｐＨ值大于4 9时上样和淋洗,此时葡萄糖氧化酶带负电荷,可被阴离子交换剂吸附留柱,而过氧化氢酶带正电荷随淋洗液流下,从而使二者得以分离,最后用ｐＨ值小于4.2的缓冲液洗柱,使葡萄糖氧化酶带正电荷而从柱上被洗脱。
5 结语
葡萄糖氧化酶不仅能够代替抗菌药物,而且还能代替抗球虫药物,是一种新型绿色饲料添加剂。随着制备提纯工艺的不断发展完善,葡萄糖氧化酶将在饲料行业中发挥越来越重要的作用。
