化学益生素甘露寡聚糖在动物营养中的应用研究进展

    一、化学益生素的定义
   
化学益生素一词译自“Probiotics”,也称前生素、益生元等,是一种非消化性食物成分,到达后肠后可选择性地为大肠内的有益菌降解利用,却不为有害菌所利用。它包括多种物质,如含氮多糖或寡糖、辅酶、某些氨基酸和维生素,甚至包括半纤维素和果胶等。但现在研究和应用较多的为寡糖类物质,如低聚果糖(FOS)、甘露低聚糖(MOS)及异麦芽低聚糖(GOS)等,其中以甘露寡聚糖的研究最为深入。

    二、甘露寡聚糖的结构及生产方法
   
MOS是由几个甘露糖分子或甘露糖与葡萄糖通过α-12、α-13、α-16糖苷键组成的寡聚糖,目前广泛使用的产品是通过发酵法从富含MOS的酵母细胞壁中提取的葡甘露聚糖蛋白复合物,约含30%的葡萄糖和30%的甘露糖。但由于受原材料来源、产量及杂质含量的影响,以微生物细胞壁为原料来提取葡甘露寡聚糖受得率较低、过程较复杂等因素的限制。
   
魔芋是葡萄糖和甘露寡聚糖以2：3摩尔分子比例结合的多糖类物质。其分子量在100万以上,是由β-1,4键结合而成的复合多糖,约50～60个糖分子单位出现一次分支。因此可以以魔芋为原材料,采用专一性酶技术制备功能性饲料添加剂-葡甘露寡聚糖,这样为生产葡甘露寡聚糖提供了一种价廉、易得的原料。中科院微生物所研制的利用碱性β-甘露糖酶生产甘露寡聚糖,该项技术利用嗜碱菌的特殊机制及极端酶的特点,用新的方法筛选分离了产生碱性β-甘露聚糖酶的嗜碱菌株,完成了菌种鉴定与系统发育分析、酶的生产条件、酶的纯化与特性、酶基因的克隆表达与序列分析、酶的高产菌株选育、甘露寡糖的组分、结构及生理功能分析,以及酶和甘露寡糖的工业生产试验等涉及多学科的系统工程,结合极端菌及极端酶的特性,以新的方法解决了酶的碱、盐、热稳定性、酶活力、寡糖生成率等本领域的多项难题,首次实现了极端β-甘露聚糖酶以及甘露寡糖的生产及应用。

    三、甘露寡聚糖的作用机理
    1.促进肠道内有益菌群优势相的形成
田允波等(1999)指出,一般情况下,猪、鸡肠道内优势种群为厌氧菌(占99%以上,而需氧菌和兼性厌氧菌只占1%),其中主要是拟杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌等。在正常情况下,动物肠道内菌群保持着动态平衡,且微生物种群中的有益菌群对整个种群起决定作用;但由于现代的集约化饲养,动物应激因素的刺激,会使原来的优势种群发生更替,而添加寡聚糖的目的就是为了恢复优势种群,使动物处于正常生理状态。
   
动物分泌的消化酶如淀粉酶只消化α-1,4糖苷键,对于其它的键几乎不起作用。甘露寡聚糖由于含有极少量的α-1,4糖苷键,因而不被动物本身利用,而只被有益菌选择性地利用,如乳酸杆菌、双岐杆菌、梭状芽孢杆菌等。同时,由于甘露寡聚糖在这些酶的作用下被消化分解产生的丙酸、丁酸等VFA明显增加,降低了肠道内的pH值,从而抑制了对酸度敏感的大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长。体外试验还表明,乳酸杆菌、双岐杆菌等能产生细菌素类的物质,这些物质对病源菌有抑制作用;Conway等发现,从仔猪消化道中分离出的多种乳酸杆菌都能产生高分子代谢产物,它们可抑制一系列革兰式阳性和阴性病原体的生长。此外,乳酸杆菌等有益菌对病原微生物有屏障作用,他们在肠道中通过磷壁酸与肠粘膜上皮细胞的相互作用密切结合,与其他的厌氧菌一起共同占据肠粘膜表面,形成一个生物学屏障,阻止致病菌、条件致病菌的定植和入侵,从而被竞争性地排泄出体外。
    2.降低病原菌的致病力
   
Abraham和Sharon的研究表明,微生物病原性的第一步是结合在消化道粘膜表面。由于外源病原菌是在肠道内大量繁殖后直接作用或通过产生毒素而导致动物发病。因此,这种结合是许多外源性细菌病的促发因素。Morgan的研究表明,病原菌细胞表面或绒毛上具有类丁质结构(植物凝血素质),它能识别动物肠壁细胞上的“特异性糖类”受体,并易与受体结合,在肠壁上发育繁殖,导致肠道疾病的发生。糖结构的多变性是决定结合作用的关键。由于病原菌的的结合受体具有特异性,因此,当肠道中存在一定量的与这些病原菌结合受体结构相识的MOS时,MOS会竞争性地与病原菌结合,而减少病原菌与肠粘膜上皮细胞结合的机会,使其得不到所需的营养而饥饿,甚至引起死亡,从而失去致病力。Mirelman(1980)进行了MOS截取病原菌的试验,用MOS可以截取50%以上的致病菌;Pusztai的试验也表明,用特定的糖来结合细菌的类丁质结构物质或用特定的类丁质结构物质结合肠粘膜上皮细胞表面的糖质或糖蛋白残基,都可达到阻止细菌与粘膜的结合。
    3.结合吸收外源性病原菌
   
许多病原菌的细胞表面含有键合碳水化合物的蛋白质,称为外源凝集素。它们可与消化道低聚糖结构的受体结合,并附着在消化道粘膜表面,从而导致病原菌在肠道内大量繁殖后直接作用或产生毒素而导致病变。MOS可与外源凝集素结合,从而破坏细胞的识别,进而使病原菌不致于吸附到肠壁上;MOS又有不被消化道内源酶分解的特点,因此,MOS可携病原菌通过肠道,防止病原菌在肠道内繁殖。Oyofo(1989)报道,MOS同病原菌外源凝集素上的活性域结合后,它们就会失活,从而失去同肠粘膜上的MOS受体位点结合能力。Ofek(1977)报道,外加的MOS可同时与上皮细胞的MOS受体结合,当MOS达一定浓度时,可使肠道上皮的MOS受体位点饱和,即使病原菌已附在肠粘膜上皮上,MOS也可将它吸附下来,即MOS可竞争吸附病原菌。
    4.调节机体免疫系统,提高动物免疫力
   
消化道免疫占动物免疫系统的很大部分,因而能对消化道起到很好的保护作用。大约体内3/4的免疫细胞分布在肠淋巴组织(GALT)内,GALT可以提供特异性和非特异性免疫防护作用:由于巨噬细胞具有吞噬和杀灭侵入体内的病原微生物的作用,所以非特异性免疫系统在动物早期的抵抗细菌过程中至关重要,MOS可以显著激活猪、狗和大鼠等巨噬细胞的活性。消化道内特异性免疫反应是由抗体(IgA)系统完成,而肠道粘膜内的IgA抗体是通过阻止细菌或有毒物质在小肠上皮细胞的附着和定植来实现其防御功能的。另外,肠道粘膜内的IgA抗体还可通过其自身产生的抗体细胞毒素直接杀灭细菌。Savage(1996)报道,甘露寡糖可显著提高火鸡血清IgA、IgG的水平。
   
Lotter(1996)报道,口服甘露寡糖能显著提高哺乳仔猪植物凝集素和淋巴细胞的转化率、白细胞的吞噬能力。Cotter等(1997)观察到日粮中添加甘露寡聚糖后,鸡肉垂对PHA的反应显著加强,并显著提高鸡血清SOD和GSH-Px活性;Yoshida等(1995)报道,甘露寡聚糖能显著提高鲶鱼的细胞活性;Savage等(1996)报道,火鸡饲喂甘露寡聚糖后胆汁分泌IgA增多,血液IgG水平显著上升。Spring
等(1998)和Carra(1998)分别报道,甘露寡聚糖可增强仔猪和狗的细胞免疫和体液免疫功能;邵良平等(1999)也研究了不同剂量的甘露寡聚糖对鸡血液中细胞免疫的影响(表1)。

表1 不同剂量甘露寡聚糖对鸡血液细胞吞噬功能和PHA淋巴细胞转化率的影响(%)
寡聚糖的添加量 数量(只) 白细胞吞噬率 PHA淋巴细胞转化率
    0g/kg         15     23.6±1.647     43.8±1.814
    2g/kg         15     25.3±1.974     47.1±3.071
    4g/kg         15     27.6±0.966     47.8±2.251

    四、甘露寡聚糖在动物营养中的应用
    1. MOS在养禽业中的应用
   
MOS提高肉鸡的日增重及饲料转化率,从而提高其经济效益。T.Plyons(1994)在肉仔鸡的育雏、生长鸡等阶段分别添加了MOS,结果表明,与对照组(饲粮中不添加MOS)相比,试验组经济效益约提高5%;甘露寡聚糖对肉鸭生产性能的影响,研究(宋勇,2002)表明:日粮中添加甘露寡聚糖可显著提高肉鸭的日增重,其中以0.1%的添加量效果最好;此外MOS对禽蛋组分也有一定的影响。Stanley等(1996)报道,添加了甘露寡聚糖的实验组与对照组相比,鸡蛋中胆固醇量降低了20.1%。
   
MOS对火鸡的生长性能影响十分明显。据Olsen(1995)报道,MOS对火鸡具有提高体增重及降低淘汰率的作用;Savage及Zakrzewska(1997)试验指出,MOS也有提高中火鸡生产性能的作用。其原因可能在于MOS可使火鸡小肠绒毛变长及鸡小囊变浅,对家禽而言,肠维持所需的蛋白和能量较多,快速生长肉鸡的合成蛋白质的12%用于消化道,肠绒毛变长意味着增大了营养物质的吸收面积,鸡小囊变浅说明组织代谢变慢以及新组织需要减少,组织代谢变慢就意味着维持所需的营养减少,动物生产效率提高(Spring
等,1996)。
   
MOS可明显改善饲料品质,由于MOS可通过物理吸附或直接与霉菌毒素结合,并不破坏毒素的化学结构,因此饲料成分不受影响。Trenholm(1998)的研究表明,MOS可结合玉米赤霉烯酮;Raju(1998)模拟肉鸡消化道体外试验表明,MOS对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和猪曲霉毒素的结合率分别为88.5%,51.6%和26.4%。Mahesh等(1996)体外试验表明,高剂量的MOS与硅酸钙钠盐对家禽饲料中AF结合率均高于80%。
    2.甘露寡聚糖在仔猪上的应用
   
由于成年单胃动物的胃肠道微生物区系一经建立就难以改变,因此许多实验结果表明,甘露寡聚糖对生长肥育猪的作用不大,但对肠道微生物区系尚未健全的仔猪作用很大,并能部分或完全取代抗生素。Bolduan(1997)报道,在5周龄断奶仔猪日粮中添加0.2%Bio-Mos(生物性甘露低聚糖)可有效控制仔猪腹泻。
Peter等(1998)研究了MOS对仔猪免疫系统的影响,其结果表明,当以胰胆汁、肠系膜及血清中IgA、IgG和IgM为衡量标准时,饲喂MOS的无菌仔猪胆汁中Ig水平差异不显著(p
>0.05)但实验组(饲喂添加MOS饲料的常规仔猪)的血清及肠粘膜中的Ig量显著高于对照组,此外,MOS还可显著提高无菌动物肠粘膜及血清中Ig水平。
   
MOS可增强淋巴细胞对细胞素的释放。Peter等(1998)的研究表明,添加MOS可提高仔猪血液中白细胞介素2(IL-2)的水平,增强T淋巴细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性。此外,MOS还可促进激活的淋巴细胞释放IFY-γ细胞素,I-FY-γ可促使巨噬细胞、体液及蛋白质移向感染部位并激活巨噬细胞,从而使其能杀死吞噬的病原菌。实验结果表明,MOS还可增强小肠内白细胞的吞噬能力,以进一步增强其抗病源菌的能力。这对微生物区系未建立的仔猪来讲尤为重要。
   
MOS可提高仔猪的日增重及饲料转化率。据Vander(1997)报道,用MOS处理1～49日龄的仔猪,结果表明,实验组与对照组相比饲料转化率提高约5%,日增重提高约7%。Dvorak(1998)在有、无抗生素存在的情况下添加MOS,均可提高断奶仔猪的日增重。
    3.MOS在幼龄反刍动物生产中的应用
   
成年反刍动物瘤胃内存在大量的降解碳水化合物的酶,因而对成年反刍动物应用MOS作用不大。研究表明,MOS可提高初生犊牛的增长速度、降低胃肠道疾病的发生率。Newman等(1993)在1～35日龄的出生犊牛的饮水中添加MOS,实验组的生长速度与对照组相比提高8%,同时采食量提高约10%,差异显著(p<0.05)。D.Dildey等(1997)在1～56日龄的幼龄犊牛的牛奶中添加MOS(其中1～5日龄添加量为4g/d,6～56日龄添加量为2g/d),实验组(摄食添加MOS的奶犊牛)平均日增重显著高于对照组(p<0.05)同时,实验组耗用的药费也大大降低。进一步研究表明,其生长速度的提高与初生犊牛腹泻病的减少有关。

    五、影响甘露寡聚糖作用效果的因素
    1.甘露寡聚糖的生产
   
目前所使用的寡聚糖产品大多为混合物且来源不同,产品中含有不同的寡糖、同种寡糖的不同聚合度,但糖、多糖及非糖类物质等可能是造成试验结果不一致的主要原因。葡甘露寡糖和葡甘露聚糖的区别就是很好的例证。高聚合度的葡甘露聚糖以粘附病原菌为主,而葡甘露寡糖以增殖有益菌(双歧杆菌)为主。
    2.甘露寡聚糖的添加量
   
甘露寡聚糖对肠道细菌所起的增殖、排阻、免疫功能必须有一定的浓度。如果添加量不足,则起不到明显的效果;如果添加量过度,则不但增加饲料成本,起不到增加有益菌增殖、提高免疫的效果,甚至还可能造成腹泻。
    3.日粮的组成
   
饲料中天然存在的寡聚糖对甘露寡聚糖的添加量和添加效果可产生一定的影响。在常用的饲料原料中,玉米中的非消化型寡糖(NDO)含量很低,大麦、小麦、大豆产品中含有大量的NDO如棉籽糖和水苏糖。因此,大麦、小麦、豆饼中寡聚糖的“掩盖效应和稀释效应”可能对实验的结果有影响(Gabert等,1994)。同时,天然饲粮中含有微生物,这给寡聚糖的有效作用发挥创造了条件;在无微生物的饲粮条件下,寡聚糖难以发挥其增加有效菌和抑制有害菌的效果或者效果不明显,这与肠道中的微生物与饲粮的供给有关。
    4.饲养环境
   
在良好的饲养条件下,日粮中添加甘露寡聚糖可能无显著效果,只有当生产性能受肠道因素影响较大时,他们才表现出显著的促生长作用(Cole,1991;Ravindran和Kornegay,1993;Rosen,1995)。Nakamura(1988)在不同饲养环境下给仔猪添加0.3%的寡聚糖试验表明:在实际生产厂,仔猪体增重13%,而在有严格卫生条件的饲养场,仔猪体增重仅为4%。这说明寡聚糖的添加效果受环境卫生条件的影响。
    5.其它因素
   
和饲料中其他营养因素一样,动物对寡聚糖的添加有一个适应期,Houdijk等(1998)报道,在断奶仔猪日粮中添加FOS,发现前三周对生长有抑制作用,但后三周有促进作用,弥补了前三周带来的损失。原因可能和肠道细菌的适应性有关。甘露寡聚糖的这方面报道未见发表。
    (参考文献略)