用农作物秸秆生产单细胞蛋白的研究

单细胞蛋白(SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白,一般指酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体所含蛋白质，其粗蛋白含量高，而且各种氨在酸搭配合理维生素含量也十分丰富，是优良的饲料蛋白。开发利用微生物发酵农作物秸秆生产单细胞蛋白饲料，不仅可以缓解蛋白饲料严重不足，还可以促进我国畜牧业结构转型，推动畜牧业进一步发展。本研究以谷草和高粱秸秆为原料，酶解后发酵生产单细胞蛋白。

1  材料与方法
1.1  原料  选择收获后露天贮存半年、无霉变的谷草和高粱秸秆（成分表1）,剪切后经植物微型粉碎机(F2102,河北黄科学仪器厂)破碎为30目试样贮存备用。

表1   原料成分

 1.2  糖液  原料在优化条件下,经纤维素酶(酶活≥15000U/g,上海丽珠东风生物技术有限公司产品)降解得到。

1.3  酵母  酿酒酵母,自选。

1.4  发酵流程  原料—粉碎—配料—灭菌(手提式压力蒸气灭菌器,YXQ•SG41•280A,上海医用核子仪器厂)一酶解一发酵(浅层液体发酵;调温调湿器DL302-1型,上海吴淞五金厂)。

1.5  分析方法

1.5.1  原料组成分析   按饲料工业国家标准。

1.5.2  定糖   DNS法(紫外-可见分光光度计WFZ-800D3A,北京第二光学仪器厂)。

1.5.3  粗蛋白质的测定   福林—酚法；双缩脲法；凯氏定氮法。

2   结果与讨论

2.1   温度的影响和发酵时间的确定   温度是影响有机体存活与生长的重要因素之一。它对生物机体的影响，主要表现在两个方面：一方面随温度上升细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快；另一方面机体的重要组分，如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，若温度升高，它们可能遭受不可逆的破坏。因此只有在一定温度范围内，机体代谢活动与生长繁殖才能随温度的上升而增加。当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如果温度继续升高，则细胞功能急剧下降或死亡。通过发酵试验，可知温度为30-32℃时,蛋白质浓度较高.温度偏高(40℃)、偏低(25℃)都不利于酵母的繁殖和生长(见图1)。

图１  温度与蛋白质产率

根据微生物群体生长规律，微生物的生长速率不是始终如一的，而是随着时间的延长，而呈有规律变化。依据微生物生长速度不同，可将菌体生长划分为4个时期,在恒定期亦称稳定期或最高生长期在恒定期亦稳定期或最高生长期,菌量最多,即蛋白质含量最高。因此随发酵时间增加必有一高峰出现，见图2。本试验在18h左右出现峰值。

图2  稳定期的确定

2.2  pH值影响与选择   环境的pH值,对微生物生命活动的影响很大,主要作用于引起细胞膜电位的变化,从而影响微生物对营养物质的吸收;改变生长环境中营养物质的可利用率以及有害物质的毒性。每种微生物都有其最适宜pH值和一定的pH值范围。低于最低或超过最高pH值时,微生物适宜在微酸性条件下发育,所以选择pH值4.4至7.0范围为本试验pH区间,试验结果见图3, 图3表明pH值5.0左右时最终产物蛋白质含量最高。

图3   pH值与蛋白质产率

2.3  原料预处理   为了考察底冰冻预处理,对酶解糖化过程的影响,取4组平行样：1：底物在灭菌之前，经过冰冻预处理，灭菌后酶与酵母一并加入，酶解发酵同时进行；2:预处理类似1，但行酶解糖化后再发酵酶解发酵分步进行；3:类似1，但不进行冰冻预处理；4：类似2，不进行冰预处理。试验结果见表2。

2与1、4与3比较说明，发酵前进行酶解的作用。由于发酵前底物已经部分酶解糖化，其产物糖类能为酵母菌的生长繁殖创造较好的营养环境使蛋白质产率提高约0.5%。1与3、2与4比较说明,底物冰冻预处理对酶解的影响。试验发现,冰冻预处理有利于酶解反应。这可能是由于秸秆所含水分结冰体积膨胀在一定程度上使纤维素结晶状态发生变化,微孔变大,比表面增加，提高了纤维素酶的可及性和酶解糖化的程度，所以最终能提高蛋白质产率。在我国大部分地区，冬季有数月冰冻期，利用自然冰冻期进行底物预处理不失为一种经济有效的工艺流程。

表2   预处理的影响

2.4  控制水料比    微生物对水分活性的要求是不同的,为了测定液量对整个反应的影响,变动水料比,测定糖化发酵产物产率,结果见表3。

表3   水料比的影响

表3说明,增加水量,蛋白质产率增大。虽然水量增加有利于物料扩散，促进反应进行，但水量过大，将增加反续处理和能量消耗。

2.5  优化氮磷比   氮和磷在微生物生长与繁殖过程中起着重要作用。氮源的生理功能，主要是合成细胞原生质、生理活性物质和细胞结构物质；而磷既是核酸、核蛋白、磷脂的重要元素，又是酶与辅酶的重要组成元素。氮磷比对发酵过程的作用十分明显。表4表明了试验控制含磷1%,改变氮含量的试验结果。表5是维持含氮1%,调整用量的试验结果。

表4   氮磷比的影响                %

表5   磷氮比的影响                %

表4、5表明，在一定范围内蛋白质产率，随氮、磷含量增加而变大；但当氮、磷浓度太大时，可能导致细胞渗透压过高，从而使细胞发生质壁分离，影响细胞的生长。

2.6添加营养无机盐     无机盐是微生物生长不可缺少的营养物质。无机盐为机体生长提供必需金属元素，维持了细胞的稳定性能调节和保持细胞的渗透平衡，可以控制细胞的氧化还原电位，提高生物活性。我们在试验中选定溶液浓度分别为1‰硫酸镁、1‰硫酸锌、5‰氯化钠,作了试验,结果见表6。

表6           无机盐的作用               %

由表6不难看出,增加酵母用量有利于在相同条件下提高蛋白质产率,试验结果见表7。

表7    酵母用量选择

综合考虑酵母成本若存在有利的投入产出比，适当增加酵母用量是可取的。另外酵母的适当活化，能显著提高蛋白质产率。

3  结论

3.1   原料应进行适当的预处理，利用自然条件实施冰冻预处理，是一种经济有效的方法。另外发酵前底物适当酶解糖化十分必要。

3.2   本工艺过程最适宜pH值为5.0左右，然酸碱度也是实用性的处理。发酵温度以30-32℃为宜,发酵时间18h左右较好。

3.3   控制适宜的氮磷比，本反应系统氮、磷含量皆控制在1%；适当使用激活剂无机盐，浓度控制在硫酸镁1‰、硫酸锌1‰、氯化钠5‰为宜。

3.4   酵母原料比选定4‰，注意减少水的用量。

3,5   不同原料，由于组成与结构不同，处理方法和蛋白质产率不同。

(参考文献略)