摘 要：抗生素在畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中残留抗生素。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。本文综述牛奶中抗生素残留的来源和危害、现状以及残留的检测方法。
关键词：牛奶；抗生素残留；微生物法；高效液相色谱法；色/质联用法；免疫法
随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视。对此，检测技术也迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量要求，保障人们饮用牛奶的卫生和安全。
1.牛奶中抗生素残留的来源及其危害
1.1牛奶中抗生素残留的来源
一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意安全时间是牛乳中抗生素残留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。在牛饲料中添加饲料添加剂已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病，这是牛奶抗生素残留的重要原因。此外，一些不法交奶户在高温季节为防止乳的酸败，往往向牛乳中掺杂各种抗生素，这也是乳中抗生素残留的一个来源。1983年，Egan调查表明，用经抗生素治疗的乳牛用过的挤乳器给正常乳牛挤乳，可使正常牛的乳中残留抗生素，所以挤乳是乳中抗生素残留的另一个来源。
1.2牛奶中抗生素残留的危害
牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物，由于长期大量使用，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。这种情况又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，同时也造成牛奶生产者的经济损失。
2.牛奶中抗生素残留的现状
牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视。1991年底，美国食品药物管理局（FDA）报告，在234个鲜乳样品中只有一个样品检出磺胺二甲嘧啶，其残留量低于10×10－6允许量。1992年上半年又检查了197个样品，结果有4个样品检出磺胺残留，但残留量在安全水平以下，均没有检出四环素、氯霉素和青霉素。1990～1991年期间，美国奶业基金会（Milk Industry Foundation）对牛乳和生产乳制品会员厂进行全面的药物残留检查，抽查率90％以上，结果为：1990年不合格率0.12％，1991年0.8％；并规定超过允许量标准的牛乳及其乳制品全部废弃处理，不得食用。欧美国家多年前即明文禁止抗生素残留超量的牛奶上市（对青霉素类药物的限量为4～10μg/kg）。
我国过去对牛奶中抗生素残留卫生指标无明文规定，直到2001年10月，农业部发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，对新鲜牛乳的卫生指标明确了“抗生素不得检出”。但对这一行业标准，我国目前并未能严格执行，致使我国牛奶及奶制品中抗生素残留问题一直未能得到解决，以至引起了人们对牛奶安全问题的担忧，并成为越来越受关注的热点。
1988年，周树南对江苏省8市10个牧场的鲜奶、消毒牛奶和奶粉中抗生素残留情况进行调查，结果发现鲜奶阳性率3.6％，消毒牛奶11.4％，奶粉39.58％。李权超(1991)、王晓光(1992)测得长春市市售鲜牛奶中抗生素残留阳性率3.3％，可疑率18.3％和2.5％。张利琴(1999)、常建军(2000)测得西宁市市售鲜奶中抗生素阳性率分别为2％、11.7％和5.3％。
葛华等（1996）对西宁市各类奶样进行调查，共采集奶样187份（奶牛场生奶110份、牛奶公司袋装消毒奶35份、私人沿街售奶42份），检出有抗生素残留奶8份，阳性率4.3％。王春奕等(1996)检测的5批25份市售消毒鲜牛奶中抗生素残留质量分数在1.5×l0－9以上，超过了世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)规定的奶中青霉素含量为0的标准。并认为这可能与饲料中添加的抗生素过量和兽医临床大剂量长期使用抗生素有关。马群飞等(2002)对福建省生牛乳抗生素残留情况进行调查，结果86件鲜乳样中共检出抗生素残留阳性样品17件，检出率19.8％。据此提出福建省乳牛散养农户生产的生牛乳抗生素残留阳性率较高，应通过改善饲养条件和加强监测予以控制。
从以上情况可以看出，我国牛奶中抗生素残留现状并不令人乐观，有关部门应加强对牛奶生产的管理，并对牛奶中的抗生素等药物残留进行有效检测和监控，以保证人们饮用牛奶的卫生和安全。
3.牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展
3.1微生物检测法
微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用,来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。采用传统的微生物检测方法，缺点是：(1)时间长；(2)显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，对微红色者无法做出准确判断；(3)操作复杂。优点是费用低，一般实验室都能操作。其中，
纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。
3.1.1纸片法
纸片法，即PD法(Paper Disc)。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β－内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素（或β－内酰胺类），对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。然后再行检测，检测限可达0.01 IU/mL。而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中β－内酰胺类抗生素，并能暗示是否还存在其它抑菌物质，检测限可达0.008 IU/mL以下。一般在4h内即可获得结果。因此，在实践中嗜热脂肪杆菌纸片法比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。此外，神保胜彦(1991)对纸片法作了进一步研究和改进。改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
3.1.2 TTC法
TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409—85)。该法简便、快速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。检测各种抗生素所用的TTC法试验的灵敏度（最低检出量）分别为：青霉素0.004 U/mL，链霉素0.5 U/mL，庆大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。
目前趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。如美国和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺实验法（CAST）。此外，美国近年来补充的一个新的实验方法－快速抗生素筛选法（FAST）。
尽管这些快速微生物检测法有时会产生一些假阳性，但在某种程度上是允许的；如产生这类情况，可进一步做确证实验。
3.2理化检测法
理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高。在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。
3.2.1高效液相色谱
高效液相色谱(HPLC)是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。几乎所有的化合物包括高极性／离子型待测物和大分子物质，均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细(ф 5～10μm)，需高压泵推动，柱效高(105塔板／m)，速度快，灵敏度与GC相近。与GC相比，HPLC流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值等可灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得以分析。反相HPLC发展最快，目前已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。主要原因是：(1)化学键合固定相(C18或C8)性质稳定，不淋失；(2)使用水、甲醇或乙腈等水溶性有机溶剂作流动相，不干扰紫外检测，成本低；(3)样品中极性杂质先流出，只需待测物出峰后即可重复进样，分析速度快。
最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。紫外检测器(UVD)最普及，其次是荧光检测器和电化学检测器(EChD)。由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此一般都通过柱前衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。彭莉等报道了用高效液相色谱法（HPLC）检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用紫外检测器在278nm检测样品。平均加收率94.8％，变异系数< 12.0％。此方法样品前处理简单、回收率高、实用性强、检验灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。由于大部分抗生素在高于230nm的光谱区无吸收，而在低于230nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰，需衍生化后测定，限制了紫外检测器的应用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光检测器有很大发展潜力。旋光检测有以下特点：(1)选择性高，样本仅需简单提取即可；(2)灵敏度高，利用He－He激光作光源，灵敏度可达5～10uα水平；(3)可同时得到流出组分的比旋度[α]，用以定性。目前，该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。
此外，光二极管阵列检测器(DAD)是近10年来HPLC最重要的突破。DAD可同时接收整个光谱区的信息，在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理后得到色谱—光谱的三维图谱，信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息，灵敏度亦明显提高。
3.2.2联用技术
各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短，一般集分离、定量和定性(分子结构信息)于一体，因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术，有TLC－MS、GC－MS、LC－MS、CZE－MS、LC－NMR、SFC－MS等。TLC－MS是最简单的离线联用技术。GC－MS已相当成熟，应用相对较多。但这些联用仪价格昂贵，远不如HPLC或GC那样普及。
MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。使用微型柱(15×0.3cm id)和适宜的接口技术，如热喷雾(TSP)、微粒束(PB)等解决了LC与MS的连接问题；使用软电离技术，如快原子轰击(FAB)、场解吸(FD)等解决了难气化物质的离子化问题。LC－MS现在已进入实用阶段，其灵敏度较荧光检测器高1个数量级，能方便地对ng级的兽药残留组分进行检测与结构确证。LC－NMR还可提供待测物立体化学方面的信息。
LC/MS是除GC/MS之外的一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。LC/MS对高沸点、不挥发和热不稳定的化合物分离和鉴定具有独特的优势。色/质联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、GC/MS、LC/MS联用法等。使用电子轰击离子化、化学电离、快速原子轰击、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学电离（APCI）和电喷雾电离（ESI）技术对不同MS离子源条件下青霉素类药物分子碎片类型的特征已经作了大量的工作。另外离子阱质谱技术（MS/MS）也已用于鉴别青霉素类药物。如Straub等使用LC/ES/MS测定了牛奶中的几种青霉素残留。青霉素，邻氯青霉素与苄青霉素的最低测定限为3～5μg/kg。Kihak 等以NCI方式的LC/PB/MS技术成功地对牛奶中OTC、TC与CTC残留进行确证，方法检测限为0.02～0.05μg/mL。
3.2.3其它理化检测方法
牛奶中抗生素残留检测方法还有气相色谱法（GC）、高效薄层色谱（HPTLC）、超临界流体色谱(SFC)和毛细管区域电泳法(CZE)等。这些方法尽管在残留检测中不常用，但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。如GC有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测器(FID)、氯磷检测器(NPD)等，检测限可达μg/kg级；HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(Φ3～10μm)改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足，但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点，可使用正相或反相板，分辨率几乎与HPLC相当，在抗生素残留的快速筛选性检测方面应用广泛；SFC可弥补GC和HPLC的不足，方便地连接各种灵敏的检测器(MS，ECD等)；CZE是90年代以来研究最活跃的分析技术之一，兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点，柱效高达105塔板／m。
Nishi等(1989，1990)使用CZE和MEKC成功地分离了十几个β－内酰胺类抗生素。CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小，限制了检测的灵敏度。CZE－MS可能是最好的解决办法。
此外，随着接口技术的显著改进，质谱作为一种质量流速型检测器，正广泛应用于残留分析的检测中。电化学检测器也已用于检测邻氯青霉素、头孢菌素和青霉素。
3.3免疫法
目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(immunoassays，IAs)，如RIA、ELISA、固相免疫传感器(soindphase immunosensor )等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(immunoaffinity chromatogrphy,IAC)。与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。以使用微量滴板的ELISA为例，免疫测定法取样量小，前处理简单、容量大，仪器化程度低，检测奶与GC/MS或GC/ECD相似，可方便地达到ng/g～pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上。目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、四环素、莫能菌素等。
免疫分析能与其他技术联用。在联用方法中，免疫分析技术既可作为HPLC或GC等测定技术的样品净化或分离手段，如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC；也可作为其离线或在线检测方法，如HPLC/IA、TLC/IA、CZE/IA、SFC/IA、FIA/IA等，这些方法结合了免疫分析的选择性、灵敏度与HPLC、GC等技术的高速、高效分离和准确检测能力，使分析过程简化、分析成本下降，拓展了待测物范围。在HPLC/IA等分析中，IA一般作为离线检测方法。又称免疫图谱法（immunograms），适用于液相检测器无响应或分离困难的残留组分的检测。FIA/IA可以实现IA的动态、实时和自动检测，分析速度快，已发展为一种专门的免疫测定技术－FIIA。
ELISA试剂盒是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法。各类抗生素试剂盒为国外生产，这使得国内的奶及奶制品公司花费较大。如德国拜发公司生产的抗生素检测试剂盒，一个96次检测试剂盒要花3800元，每个样品的检测要花30～50元。对一家中小型奶制品企业而言，每年在抗生素等药物的检测上要花费20多万元以上。因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降纸成本，提高经济效益。
4.结束语
综上所述，鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，应重视和加强检测工作，并努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选多残留分析技术；发展高效、高灵敏的联用技术和多残留组分确证技术，如LC—MS、CZE—MS；实现分析过程自动化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保证消费者的健康。
