减毒沙门氏菌活疫苗研究现状及其在家禽业的应用
张 欣
(Department of Biology, Washington University, St. Louis, Missouri, 63130, U.S.A.)
沙门氏菌 (Salmonella enterica)是一类肠道杆菌，包括两千多个血清型。其中的一部分可以导致人和动物的感染，造成局部和系统性疾病，统称为沙门氏菌感染或沙门氏菌病(Salmonella infection or Salmonellosis)。沙门氏菌经口感染，粪——口途径传播，可被感染家禽、家畜及啮齿类动物携带、排泄，污染环境、水源、饲料、食品，造成流行和传播。近几十年来，沙门氏菌感染因其对人类和禽、畜饲养业造成的危害而受到广泛重视。
家禽（Poultry）的沙门氏菌感染一直是饲养业和公共卫生的主要问题。西方国家目前注重预防沙门氏菌由禽向人的传播，而包括中国在内的发展中国家则更侧重于沙门氏菌感染对家禽养殖业本身的影响。
禽沙门氏菌感染(Poultry Salmonella infection)可分为宿主特异性（Host-specific) 和宿主非特异性 (Host-nonspecific)。前者由该属细菌中的鸡伤寒沙门氏菌(S.gallinarium) 和鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)引起，该菌具有高度宿主特异性,多数情况下仅感染家禽和某些鸟类。S. pullorum在雏鸡引起鸡白痢 (Pullorum Disease, PD), S.gallinarium 引起鸡伤寒 (Fowl Typhoid, FT)。后者(宿主非特异性感染)则可由沙门氏菌的其他血清型引起，主要有鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、 肠炎沙门氏菌 (S.enteritidis)、海登堡沙门氏菌(S.heideberg)、 海德沙门氏菌 (S. hadar) 等。
传统的灭活疫苗(Killed vaccines)和亚单位疫苗(sub-unit vaccines)虽然一直在沿用，但由于免疫效果不佳、免疫途径不便而逐渐被活疫苗所取代。现代生物学和DNA重组技术以及对沙门氏菌毒力遗传学(Genetics of Salmonellavirulence)的深入研究和了解，为在该病原体基因组中引入多重(Multiple)、限定(Defined)、减毒(Attenuat)和不能回复(Irreversible)的突变提供了可能性。这种突变是制备减毒活疫苗(Attenuated live vaccine) 的遗传学基础。
与灭活疫苗、亚单位疫苗相比，减毒活疫苗具有高效、低花费、方便使用等优点。理想的活疫苗应具备下列条件：①完全减毒(Completely attenuated)。而突变后的残余毒性一般不能被接收。②高度免疫原性(Highly immunogenic)。活疫苗应能够有效的刺激机体产生特异性保护性免疫(Protective immunity) 反应。③不能回复突变(nonreversible)。限定性多重性缺失突变(Defined multi-deletion mutations)可防止回复突变的发生。④对环境不造成污染。疫苗应在体内存留特定的时间，诱导免疫反应后被某种机制清除并不滞留于环境。⑤对后代(progeny)无害。疫苗所诱导的保护性免疫应能传给下代，而疫苗本身不应垂直传播。⑥经济且方便使用。诸如口服、喷雾途径较肌肉注射简单、方便。
以下分别叙述两类沙门氏菌感染的特点和减毒活疫苗研究。
1 宿主特异性沙门氏菌感染－鸡白痢(PD)和鸡伤寒(FT)?
PD和FT在病因学、病理学、症状学、流行病学以及控制、预防等诸多方面都非常相似，常被一并叙述。S. gallinarium and S. pullorum 由于其血清学相似性常被视为同一种细菌，或后者是前者的生物型(Biotype)。该菌经口感染后，经肠粘膜和肠道淋巴系统 (Peyer"S Patches, Caecal tonsil)，经由血流到达肝、脾、骨髓及其他脏器。此间细菌大量繁殖，导致器官病变和感染动物死亡。该病的病程可呈急、慢性和系统性。
对于该病的控制和预防在西方国家较为成功。自1888年美国首次发现FT，1889年首例报道PD及其对病原菌的描述，该病曾一度在美国和其他国家流行并造成养禽业巨大损失。美国政府从三十年代起推行所谓家禽改进计划(NPIP)，该计划包括PD的控制部分，1954年又将FT的控制列入该计划，其核心内容是检疫淘汰制，通过血清学方法检出感染禽只予以淘汰，后者常导致整个养殖场的关闭和焚烧。NPIP的实施导致了PD和FT在美国的净化和消灭。尽管九十年代后美国曾有数例PD爆发流行的报道，该病目前在西方国家仍不构成严重威胁。笔者认为这也是发达国家不再重点发展PD/FT疫苗研究的主要原因。
中国目前的养鸡业，PD和FT仍是危害严重的细菌感染之一，对其控制亦主要是采用检疫淘汰制，并使用抗生素预防、治疗。近年亦有使用健康成年鸡肠内容物竞争抑制方法的报道。这种综合防制措施虽然在某种程度上控制了该病的大规模爆发流行，但相对耗时、耗资、耗力。抗生素的滥用导致多重耐药株的筛选，对病禽乃至人类病原菌感染的治疗造成困难。家禽体内抗生素的残余剂量使消费者在食用鸡肉鸡蛋及其制品的同时摄入不必要的抗生素。
2 宿主非特异性沙门氏菌感染?
宿主非特异性沙门氏菌具有相对广泛的宿主。一种血清型可同时引起人类、动物包括禽类的感染。该类沙门氏菌通过食物链传播，造成人的肠炎、食物中毒，甚至引起爆发流行。这种情况八十年代起在欧洲出现，近十年亦已成为美国公共卫生的主要问题。1980年至1989年的十年间，苏格兰发生的家禽疫源性沙门氏菌感染占整个沙门氏菌感染的85％。英国、瑞士、捷克等国家也先后报道类似禽源性沙门氏菌感染的爆发流行。同时，这些国家的养鸡业也因此遭受巨大损失，大量鸡群被淘汰，许多鸡场被关闭，无数鸡蛋被销毁。加之西方昂贵的医药费用，卫生防疫和疾病控制部门已将该类沙门氏菌感染列为预防重点，商品禽蛋及其制品亦被认为是目前最重要的沙门氏菌库（Salmonella pool）和感染源。?
美国CDC（疾病控制中心）按从人类检出的频率将不同血清型的沙门氏菌排出下列顺序，S.enteritidis, S. typhimurium, S. heideberg, S. newport, S. hadar, S. agona, 等。前两者由于感染的普遍性而最为重要，该菌感染家禽后，多不引起系统病症，但可在肠道定居并大量繁殖，经由粪便排出。带菌和排菌状态可持续数周数月。这种感染特点是造成人类禽源性沙门氏菌感染的主要病原学和流行病学基础。
3 预防宿主特异性沙门氏菌感染（PD－FT）的活疫苗
最早的减毒活疫苗是 S.gallinarium 9R突变 株 (Smith, 1956)。该株是野生型 S. gallinarium 9 株的粗糙型突变体(Rough mutant)，不能合成LPS，由将野生型通过低营养培养基反复培养后得到。9R株的效果自1956年起曾被多次鉴定和评估 (Gordon, 1959. Silver, 1981. Barrow, 1991)。该突变株可在成年鸡诱导对 S. gallinarium 野生型感染的保护性免疫反应，但具残余毒性，可致肝、脾损害，并可在体内滞留数周、数月，通过鸡蛋进行传播。Barrow 等人进一步将野生型9株的毒力质粒消除，该消除株在4周龄鸡体内减毒，肌注免疫可诱导对野生株的口服攻击，但效果不如9R (Barrow,1987, 1990)。
沙门氏菌由chorismate 合成生长因子 para-amino-benzoic-acid (PABA) 和2,3,-dehydroxybenzoate (DHB)，而前者是芳香族氨基酸合成代谢途径(Aromatic amino acids biosthetic pathway) 的终产物。aro 基因缺失的突变体因不能合成上述生长因子并且不能从动物组织内获得足够的量而失去毒力(Stocker, 1993； Hoiseth, 1981；Griffin, 1993). Griffin (1993) 等人利用噬菌体插入失活的方法构建了 S. gallinarum 的芳香型氨基酸缺陷型(aroAmutant）。该突变体对两周龄鸡高度减毒，但所诱导的保护性免疫力低下，不能象9R株一样有效。
最近的一篇报道(Zhang-Barber, 1998) 描述 NADH 脱氢酶基因（nuoG) 缺失突变体的构建、鉴定和免疫效果实验 。该实验室将Kanamycin 抗性决定簇插入 nuoG基因，造成该基因失活。nuoG株高度减毒，不能定居两周龄鸡的肝、脾脏，定居盲肠部位的能力与野生型相比大大减弱，单一剂量口服免疫使两周龄鸡患病率降低 8%～75％不等。
4 预防宿主非特异性沙门氏菌感染的活疫苗?
galE 突变株：galE 基因缺失的突变体不能产生乳糖异构酶(Galactoseepimerase)，因而不能由尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)合成尿苷二磷酸乳糖（UDP－Gal），并不能进行二者之间的相互转化，而后者是沙门氏菌脂多糖（LPS）的组分。galE突变体在缺少乳糖的培养基上呈粗糙型生长。在外源性乳糖存在的情况下，galE株可利用乳糖激酶（galactokinase）和乳糖1－磷酸尿苷转移酶（Galactose 1-puridyl transferase）合成UDP-Gal，将其掺入LPS。但是，乳糖异构酶的缺失导致乳糖1磷酸（Gal-1-P）和UDP-Gal的堆积，对细胞造成毒性。因此，galE 株对乳糖高度敏感。galE突变株在小鼠和小牛体内毒力减弱（Germanier,1975;Wray C 1977, 1983）。一日龄雏鸡经鼠伤寒沙门氏菌 galE突变株口服免疫后产生保护性免疫，两周后用野生株攻击，粪便排菌量显著降低，带菌状态的形成明显改善（Pritchard, 1978；Wray C1983）。
aroA 突变株：aroA突变的机制如前所述。aroA突变株在小鼠模型表现良好，动物经免疫后产生特异性抗体反应、细胞免疫反应及整体保护性免疫反应。鼠伤寒和都柏林沙门氏菌的aro 突变株在牛、羊等家畜体内亦诱导良好的保护性（综述：Mastroeni 2000）。Cooper等人（1990、1992、1993、1994 a,b）对肠炎沙门氏菌 aroA 突变株对家禽的免疫效果进行了系统的实验研究。aro 突变株经口感染一日龄雏鸡后可在小肠定居，并可在盲肠繁殖，但不引起病症，同时诱导抗野生型的保护性免疫反应。用野生型菌株口服攻击免疫动物，其在肝脏、脾脏、卵巢、盲肠等器官的定居水平及经粪便的排菌量都显著降低。野生型沙门氏菌由感染鸡向免疫鸡群的传播途径亦被阻断。此外，粗糙型的aroA突变株和9R株相比，后者的保护性较前者为好。
aroA突变株在鼠伤寒沙门氏菌与肠炎伤寒沙门氏菌之间不诱导保护性交叉免疫反应。
pur E 突变株：pur 基因突变影响单磷酸腺苷（AMP）的合成，pur 突变体的生长需要补充腺嘌呤（Adenine)。该突变体在小鼠模型高度减毒（McFarLand 1987)，但免疫原性低下，诱导产生的保护性免疫反应较弱。鼠伤寒的purE 株在家禽表现良好的免疫效果，目前在德国较为广泛地使用。?
cya crp 突变株：cya crp 基因编码腺苷环化酶（Adenylate cyclase）和环化腺苷酸受体蛋白（Cyclic AMP receptor protein）。该基因调节多种功能，包括碳水化合物及氨基酸的利用，鞭毛、菌毛合成，外膜蛋白合成，多种基因表达等。Hassan and Curtiss (1994, 1996a/b, 1997) 对于该突变进行了系统的研究 。他们发现鼠伤寒沙门氏菌 cya crp的缺失突变体对一日龄鸡的半数致死量大于3X109 CFU(Colony formingunit)，可保护一日龄、两周龄、以及成年鸡抵抗野生型攻击感染。经免疫蛋鸡后，可由鸡蛋和子代雏检出垂直传播的抗沙门氏菌菌体抗原的抗体，该子代同时表现对野生型定居的限制。此外，该突变株在小鼠体内减毒并诱导特异性抗体和高度保护性免疫 (Zhang,1999)。该疫苗已获美国农业部批准，在美国和欧洲某些国家和地区销售。
5 关于减毒沙门氏菌的安全性和遗传稳定性?
尽管减毒活疫苗有着许多优越性，但是与传统的灭活疫苗相比，需要考虑的是它对环境和人的影响以及经历基因操作后疫苗自身的稳定性。最近发表的几篇文章报告这方面的工作。Barbezange (2000a,b) 小组比较了三个活疫苗在单一动物和群体以及环境中的分布和滞留情况，发现它们在消化道和肝脏滞留和被清除的时间由10天至10周不等，在环境中滞留可达8周以上。
三株疫苗的限定性内切酶片段有两株表现出变化。说明在实际环境中活疫苗有可能通过基因重组的方式改变染色体结构，进而改变毒性和抗原性。
