关键词：寄生虫病，免疫预防， 疫苗， 防治
动物寄生虫病由于广泛的流行性和传染性而成为严重危害畜禽和人类的重要疾病，每年给我国畜牧业造成巨大的直接经济损失，间接经济损失更是难以估计，人畜共患寄生虫病仍然危害着成千上万人的生命安全。当前世界各国对动物寄生虫病的防治日益重视，除进行综合治理和研究新型抗寄生虫药以外，投入人力、物力和财力开拓药物以外的防治途径，尤其是从免疫预防入手，利用现代免疫学、生物化学和分子生物学理论和方法对动物寄生虫疫苗开展研究，取得了一系列可喜的进展。
1研究概况
关于寄生虫病的防治对策历来存在着两种观点：一种认为应以药物防治为主，理由是寄生虫抗原成分复杂，制苗不易，而且效果不佳；另一种认为应以免疫预防为主，因为寄生虫与细菌、病毒一样，通过感染可提高动物宿主对再感染的抵抗能力，这种获得性免疫还能减轻寄生虫对宿主的病理损伤，这些现象说明可以用免疫预防的方法来达到控制寄生虫感染的目的[1]。在80年代以前，驱虫药市场成为动物药品市场中增长最快的部分，使得一些主要的寄生虫病，如血吸虫病、牛羊肝片吸虫病、绦虫病、胃肠道和呼吸道线虫病及球虫病等在一定程度上得到了控制，从而也限制了对免疫预防的投入。然而，由于长期使用化学药物治疗寄生虫感染，出现抗药性问题和药物残留的问题，以及关于化学药品对环境不良影响的担忧，停止使用化学驱虫剂的呼声越来越高[2]。另一方面，由于疫苗的安全性、没有化学残留和污染环境，更能被接受，所有这些成为寄生虫疫苗研制的主要推动力。
寄生虫病的免疫预防研究起步较晚，落后于其它病原微生物（如细菌、病毒），目前已商品化的细菌和病毒疫苗有许多种，免疫预防已成为抗病毒感染的主要手段，而抗动物寄生虫的疫苗则寥寥无几就是最好证明。一个简单的事实是，寄生虫疫苗不像针对细菌和病毒那样容易成功。而根本的原因是寄生虫是比细菌和病毒更复杂的生物，寄生虫是真核生物，大多数是多细胞动物，有着复杂的生活史，体外培养十分困难，绝大多数寄生虫还不能在人工条件下离宿主培养获得虫体，寄生虫抗原十分复杂，并通过种种复杂方式如抗原变异、抗原伪装、表面抗原脱落与更新等来逃避或扰乱宿主的免疫防御反应，使宿主难以产生有效的保护性免疫反应[3,4]，这些均给寄生虫疫苗的研制带来了困难。
然而，现代生物技术的发展及在寄生虫学的应用，尤其是分子生物学技术的应用，使寄生虫免疫学研究不断取得进展，各种寄生虫的抗原变异机理不断被揭示，保护性抗原分子的鉴定和抗原基因的分子克隆不断取得进展，为研制基因工程疫苗防治寄生虫病奠定了基础。近十多年来，经过科学家的艰辛努力，寄生虫基因工程苗已初露端倪，取得了一些令人鼓舞的成果，相信在不久的将来可以看到更多的寄生虫疫苗投入应用。
2 囊尾蚴病和棘球蚴病疫苗
囊尾蚴病和棘球蚴病是发展中国家主要的人畜共患病，危害非常严重。可喜的是囊尾蚴及棘球蚴重组疫苗的研究均相当成功。棘球蚴苗EG95可诱导牛产生96%-100%的保护率，这已在澳大利亚、新西兰、阿根廷及中国等地的试验中获得证实[5]。在绦虫方面，羊带绦虫45W-GST融合蛋白是第一例成功的抗寄生虫重组虫苗(Johnosonetal)，45W-GST可以诱导较高水平的IgG1，IgG1的水平与保护率呈正相关，可诱导羊产生92%以上的保护率，对牛的无钩绦虫也有较高的保护率，该重组抗原即将商品化。此外，还有16kDa和18kDa的抗原分子(To18/To16)也已被克隆，而且被证明也有保护力，这些抗原可以交替使用，避免羊羔体内的母源抗体对相应抗原初次免疫的干扰[7]。其它绦虫中，有人报道了用六钩蚴抗原来免疫预防细粒棘球蚴和牛带吻绦虫。EG95、45W及羊带绦虫中含类似结构的其他抗原To18/To16均是在大肠杆菌中诱导表达的，具有种间交叉保护作用。如羊带绦虫的45w、To18及To16抗原混合后可诱导猪对有钩绦虫的攻击感染产生保护，保护率达93%。另有一些抗原，如六钩蚴的FABP，亦可作为疫苗侯选抗原。Chabalgoity等(2001)以减毒沙门氏菌为受体菌，表达了该抗原FABP，经口免疫犬后，发现可诱导相应的体液及细胞免疫反应。更重要的是，接种过的狗不排虫卵。因为该减毒沙门氏菌对狗无害，因此对这种宿主，建议其它各种侯选疫苗也可采用这种形式使用。Johnson等构建了羊绦虫六钩蚴cDNA文库，筛选出FABP抗原并将其表达，进而制成疫苗，对羊免疫后减虫率达94%，同时此疫苗还可以交叉保护其它动物的带状绦虫感染，如牛囊虫病和猪囊虫病[8]。与牛绦虫相似，猪绦虫的基因组内也含有编码与羊绦虫的3种宿主保护性抗原同源蛋白的基因。Gauci等以猪绦虫抗原克隆表达产物作为疫苗接种猪，能有效地抗猪绦虫的感染。对于猪的抗猪绦虫感染的实验研究，多数是应用异种的羊绦虫抗原。用含有羊绦虫3种重组抗原(45W、To18和To16)的联合疫苗对猪免疫两次，当猪被虫卵实验感染后，产生的囊包数比对照组减少93%。
近年来，国内的许多学者对囊尾蚴病和棘球蚴病也进行了深入的研究，用各种方法寻找保护性抗原基因，试图研制出更为高效的疫苗。目前，研究者们正致力于寻找潜在虫苗价值的保护性抗原基因，孙树汉等用免疫筛选法筛选出猪囊尾蚴cDNA文库2个可同时被囊虫病人血清和囊虫病猪血清所识别的共同抗原1(cC1)和共同抗原2(cC2)。cC1具有极高的抗原特异性，将其做成核酸疫苗免疫小鼠后，可诱发高水平的IgG，免疫后的猪对虫卵攻击具较高的保护率[9]。吴丹等也以囊虫病患者血清为探针筛选出cC1抗原，并构建重组质粒P3-cC1，以其为DNA疫苗免疫仔猪获得73%的保护率；同时为增强cC1的免疫保护作用，还构建了表达IL-4与抗原融合蛋白的DNA疫苗[10]。另外，值得一提是王庆敏等首次在国内克隆出猪囊尾蚴B抗原（AgB）基因cDNA序列编码区，用该抗原制备的核酸疫苗pcDNA3-AgB免疫仔猪，相对保护率为80%[11]。以上所有这些研究都为研制囊虫病诊断试剂盒及基因工程疫苗打下了良好的基础。当前较为成功的疫苗有唐雨德等研制的猪囊尾蚴基因工程疫苗，用其免疫猪后，减虫率和完全保护率分别为99.2%和55.5%，该疫苗可同时激发动物的体液免疫和细胞免疫反应，增强了机体的免疫调节功能及杀伤性T淋巴细胞功能，有望达到商品化生产。同样获得成功的还有猪囊尾蚴细胞疫苗，它是目前唯一通过细胞作为免疫原的疫苗，解决了猪囊尾蚴抗原的工厂化生产技术，使得规模化生产成为可能，也为寄生虫病的免疫研究开拓了新领域，奠定了寄生虫细胞疫苗免疫学的基础。
3 吸虫疫苗
在吸虫方面，研究得比较多的是日本血吸虫和肝片吸虫，其中日本血吸虫已有许多候选抗原基因相继被克隆如副肌球蛋白(rSj97)、GST、FABP、膜蛋白(SjC23)、卵黄铁蛋白(Ferl)、抗凋亡因子(Dadl)等。副肌球蛋白是血吸虫疫苗的重要候选抗原，周金春等(2000)用重组rSj97免疫水牛，3次免疫后腹部贴片感染尾蚴，结果免疫组的减虫率为49.9%，肝脏减卵率为57.3%。GST是所有血吸虫(包括牛血吸虫)共同具有的分子量为26-28kD的一种酶，埃及血吸虫、牛血吸虫和日本血吸虫的GST具有交叉反应的抗原决定簇，可抑制虫体繁殖和影响虫体活力从而部分保护小鼠免受同源血吸虫的攻击，这使得研制广谱的抗血吸虫疫苗成为可能。徐裕信等(1999)用纯化的重组GST抗原加弗氏佐剂免疫家兔，ELISA检测血清中特异性抗体水平，结果发现从免疫后第4周起血清中特异性抗GST抗体升高，且可维持较高的水平达65周。膜蛋白(SjC23)为23kDa的保护性抗原分子，朱荫昌等(2002)用SjC23的真核表达载体3次免疫猪，然后攻击，结果发现SjC23 DNA疫苗可诱导猪产生较强的免疫保护作用。此外，尚有关于血吸虫卵黄铁蛋白、肌动蛋白抗原性及免疫保护效果的报告。除了以上已发现的侯选抗原基因外，近年来一些学者又发现了一些新的保护性抗原基因，为选择基因工程疫苗所需抗原基因提供了更大的余地。王庆林(2001)等利用感染日本血吸虫的东方田鼠血清从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选到3个新基因，其中一个为编码胞液氨基肽酶，并将此基因克隆到pGEX-5X-3载体中，利用表达的融合蛋白进行动物保护实验，减虫率可达26.57%[12]。张亮(2003)等首次利用东方田鼠健康血清结合羊抗小鼠IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达型文库，采用RACE技术克隆一日本血吸虫新基因，命名为SjMF4，构建了真核表达质粒pcDNA3SjMF4重组DNA疫苗，免疫小鼠诱导了28.64%减虫率和21.73%减卵率，表明此基因具有作为血吸虫候选疫苗的潜能，对该基因的编码蛋白作为抗血吸虫病疫苗侯选抗原值得深入研究[13]。现有的研究结果显示，血吸虫各种保护性抗原都不能诱导完全的保护性免疫力。针对血吸虫的保护性免疫机制，因保护性抗原不同，表现形式也不一样，同一种抗原难以产生针对不同虫期的保护性免疫力。因此，将几种不同的保护性抗原联合组成多价分子疫苗，以求通过不同的免疫机制产生高水平的保护性免疫力。但多价分子疫苗的保护效果如何尚有特研究。
肝片吸虫的谷胱甘肽S转移酶(GST)和许多脂肪酸结合蛋白(FABP)家族，在类似感染的牛中分别达到19-69％和55％的保护水平，GST预防绵羊感染时也能达到57％的保护水平。GST的几个同功酶基因现在已经被克隆，用重组抗原做免疫试验，绵羊的攻击感染减少48%，牛的感染减少50%。重组的FABP在人工感染肝片吸虫时不能保护兔类。近期内还很难研制出有效的抗肝片吸虫疫苗，仍需要深入地研究宿主-寄生虫相互作用，以明确寄生虫潜在的逃避机制和寻找新的疫苗靶子。另外，研究肝片吸虫病的流行病学以及肝片吸虫、反刍动物宿主和环境(中间宿主和野外终宿主存在的地方)之间的相互作用等对疫苗的研制也有重要的意义。
4 消化道线虫疫苗
血矛线虫、食道口线虫及仰口线虫是牛、羊分布最广、危害最大的一类消化道线虫病，目前主要采用芬苯哒唑和阿维菌素类药物治疗，疫苗研究也较多且有成功的报道。自此Munn等(1987)发现用存在于线虫肠道微绒毛表面的扭曲蛋白(contorton)免疫羊可使捻转血矛线虫感染下降78%后，肠道相关抗原的研究就成了吸血线虫及其他吸血寄生虫的研究热点。目前最有效的线虫疫苗，是一种用具有氨肽酶A和M活性的110KDa的整合膜蛋白（Hll）制作的疫苗，试验效果非常明显：在持续23周的人工感染时，可使绵羊羔达到90％以上的保护率，并且对自然免疫不产生干扰，某些保护能通过初乳中抗体传递给羔羊。其它与捻转血矛线虫肠道有关的抗原如H-gal-GP、TSBP在羔羊中也能达到高水平的保护。对如此多具有预防性分子的认识，预示着预防这种寄生虫的基因工程疫苗未来美好的发展前景。尽管许多抗原基因已被克隆和表达，然而对表达产物的抗原性和免疫保护性研究很少。国外在重组H11、H-gal-GP及TBSP疫苗方面的进展很快，但上述所有分子的抗原表位都含有复合糖的组分，很难在常规表达载体(E.coli、酵母及病毒)中正确表达。故Redmond等(2001)开始用易于体外繁殖且能自由生活的线虫(如Caenorhabditis elegans)进行这些抗原的体外表达，已在秀丽新杆线虫成功表达了捻转血矛线虫的胃蛋白酶原(Pepsinogen)，这为研究寄生线虫提供了一个很好的模型，也为表达寄生性线虫抗原提供了合适的载体[21]。消化道线虫的基因工程疫苗研究最重要的挑战是从众多的疫苗成分中提取能产生交叉保护的单一分子，或至少是少数几种分子。在这一点上，隐蔽的肠道抗原由于不会受到免疫选择的压力，因而可能在不同寄生虫中保存，从而被认为是理想的候选物。
近年来，对钩虫多种疫苗候选分子的研究日趋深人，目前已鉴定出多种钩虫疫苗候选分子如:钩虫分泌抗原1(ASp1)、金属蛋白酶、乙酞胆碱醋酶、过氧化物歧化酶、透明质酸酶、中性粒细胞抑制因子及犬钩虫抗凝多肽(ACAP)等。ASp1尤为引人注目，它是从十二指肠钩虫分泌蛋白中分离得到的多肽分子，是钩虫排泄分泌抗原(ES抗原)的主要成份。犬钩虫ASP1(Ac-ASP1)的cDNA编码424个AA，用体外表达的Ac-ASP1腹腔注射免疫小鼠3次或用明矾沉淀的重组Ac-ASP1免疫4次，攻击感染后48h，肺部幼虫的减虫率分别可达57%或63%。进一步研究发现，用其免疫血清被动免疫的小鼠也获得了免疫保护，血清中IgG1、IgE的滴度升高，说明Ac-ASP1重组蛋白诱导的保护性免疫是由抗体介导的。金属蛋白酶(MEP)具有蛋白酶活性，同时需要以锌作为辅酶，体外重组表达的MEP免疫小鼠发现，对犬钩虫L3的感染可达60%保护率[9]。以上研究结果表明ASP1在众多疫苗侯选分子中最具潜力，有待进一步研究。开展钩虫基因组的研究也为疫苗的研制奠定了基础，Daub对美洲钩虫成虫进行表达序列标签(EST)分析鉴定得到了许多钩虫的可表达基因包括蛋白酶、脂质结合蛋白、球蛋白、热休克蛋白、蛋白酶抑制物、类血凝素、类ASP蛋白、抗细菌多肽等，对这些基因功能的深人研究有助于确定有效的疫苗靶分子，推动钩虫免疫作用机制及钩虫疫苗的研究。
5 原虫病疫苗
几种重要的家畜感染是由原虫引起的，如绵羊的弓形虫病，初生犊牛的隐孢子虫病，羔羊、犊牛和家禽的球虫病，牛的巴贝斯虫病，牛和狗的新孢子虫病以及狗的贾第虫病[16]。目前已有好几种预防原虫的疫苗在市场上销售，尤其是预防禽球虫的疫苗，广泛应用的鸡球虫疫苗有强毒苗(Coccivac和Immucox)和弱毒苗(Paracox和Livacox)。预防球虫病的重组疫苗正在进行研究，尽管在研制预防这些原虫的重组疫苗中付出很多努力，还不能得到像蠕虫疫苗那样的成功结果，但也取得了一定进展。应用表达的球虫E.acervulina株的折光体蛋白(Ea1A)，可降低感染鸡的球虫卵囊产量，鸡的增重下降也得到改善。该抗原基因也可在E.tenella中克隆，说明无种间特异性，这与活苗免疫的种特异性形成鲜明对比，故折光体蛋白是基因工程苗的合适候选抗原。Pogonka等用重组SO7-沙门氏菌口腔免疫3 周龄白来航鸡, 两周后测到了抗SO7 的特异性抗体, 抗体水平维持了6 周[18]。用活菌口服菌体蛋白肌肉注射、DNA疫苗肌肉注射等方法免疫鸡，发现对致死剂量的攻击感染产生良好的免疫保护，排卵减少率达48.5%-80.1%，盲肠病变值降低20%-58%[19]。相对于其它的疫苗，球虫核酸疫苗的研究起步较晚，Kopko等(2000)将E.tenella SO7’基因插人pcDNA3.l，构建了核酸疫苗，并进行了动物保护试验。试验发现肌肉注射25ug pcDNA3-SO7’可诱导机体产生较强的免疫保护，表现为盲肠病变值降低，体重下降减少[9] 。中国农业大学寄生虫病研究室自1997年以来先后克隆和表达了十多种E.nenella功能抗原基因，采用核酸疫苗来预防弓形虫病和隐孢子虫病的研究试验也取得有价值的成果。
到目前为止，虽已鉴定和克隆了许多鸡球虫基因，但用重组抗原免疫鸡，只能诱发对球虫病的部分保护，还不足以有效控制田间球虫病。主要原因是产生这种部分保护性的重组抗原，只是某一种球虫的某一阶段抗原。而鸡球虫生活史复杂，基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异，各阶段都有保护性抗原，不同种类球虫的免疫原性也不同。因此，需进一步研究免疫保护机制，对不同虫种、不同阶段的保护性抗原进行鉴定和分离，尽可能多的筛选保护性抗原，联合制成多价疫苗。此外，采用合适的载体系统改善提呈抗原如活的病毒载体，也是提高保护率的有效方法。进一步筛选球虫保护性抗原基因并在免疫接种方式及佐剂等方面深入研究是球虫基因工程疫苗今后的发展方向。
6 外寄生虫疫苗
蝇、虱、螨、蜱等外寄生虫严重危害着牛、羊的健康。在预防这些寄生虫的疫苗研制过程中，一个重要的里程碑是第一种大肠杆菌表达的基因工程Bm86疫苗——TickGardTM的出现，它是由澳大利亚Biotech及CSIRO(联邦科学及工业研究组织)共同研制而成，用于预防牛的微小牛蜱(willadsen，1995)。与此类似的是古巴用酵母pichia Pastoralis表达的Gavac苗，并由HeberBiotec公司生产。现在Biotec公司生产了第2代微小牛蜱苗Tick-Gard Plus，免疫效果更强，已在加拿大获准生产。目前还有许多预防其它寄生虫如东方血蝇的疫苗正在研制中。一种针对牛纹皮蝇的蛋白酶（hypodermin A）的重组疫苗在试验中获得成功，已被批准并由加拿大的Alberta作为商品疫苗销售 [5,15]。除以上两种疫苗外，对其它体外寄生虫如旋皮蝇、蛙虱等也都有相应的疫苗正处于研制之中。用疫苗预防体外寄生虫，避免了使用杀虫剂和杀螨剂等化学药品所带来的药物残留、药物副作用和耐药性虫体增殖等问题。虽然其发展还处于初期阶段，但却为寄生虫的研究和控制开辟了新途径。
7 展望
随着各学科的迅速发展和相互之间的渗透，对兽医寄生虫学家来说，目前可以利用的知识和技术有很多，如果能正确恰当地利用它们，将会使一些基因工程疫苗的研制成功变成现实。
7.1寄生虫基因组、蛋白质组工程
随着人类基因组工作的开展，有许多寄生虫学工作者也在开展寄生虫基因组研究，这将为兽医寄生虫学提供有关耐药性机理、抗原变异和基因多样性等寄生虫生物学方面知识，确定提供新的药靶的关键基因和有潜在疫苗价值的抗原，有助于药物和疫苗的研制。对寄生虫基因组的研究，还会在流行病学的株系鉴别上起重要的作用，也会对寄生虫多态现象做出解释。蛋白质组具有的高通量、大规模、整体性蛋白质水平的研究是了解寄生虫的生长、发育，开发疫苗和药物的有利工具。目前，蛋白质组学研究技术在寄生虫学中应用还仅处于起步阶段。相信不久的将来，随着寄生虫蛋白质组学深入开展，有助于人们查明诸如寄生虫生长、发育机理、免疫逃避机制以及寄生虫与宿主的识别和信号递送、抗药机理等一系列问题。例如利用结构蛋白质组学技术，可对寄生虫抗原表位高级结构分析，模拟抗原表位，实现无虫属抗原的免疫应答；利用比较蛋白质组学技术，可以筛选抗药性虫株的标记蛋白或分析不同时期、性别的内分泌、外分泌功能抗原等等。寄生虫基因组、蛋白质组研究技术在寄生学中的应用将会揭开人们认识寄生虫和寄生虫病的新篇章，将为研制防治寄生虫病的新疫苗、新药物开拓新途径。
7.2 寄生虫生物学
重视寄生虫学的基础研究，以寄生虫的形态学为基础，结合生态学、免疫学、蛋白质分析技术、核酸分析技术等综合分析，对一些难以明确分类地位的虫种进行分类鉴定和种系发生研究；加强重要寄生虫和新发现寄生虫的病原生物学研究，描绘形态结构，探明生活史，阐明宿主与寄生虫相互影响的研究。所有的疫苗都是在研究寄生虫在其宿主中生存的方式这个过程中发现的，即它们如何吸食、穿透组织和避免宿主免疫效应细胞和分子的攻击。因此，我们应该应用现代生物技术、免疫学技术开展寄生虫生理生化、抗原变异、寄生虫病的分子流行病学、免疫机制等研究，为寄生虫病免疫预防提供基础。
7.3免疫学
现代生物技术发展日新月异，为寄生虫病免疫学研究提供了强有力的武器。研制疫苗的基础是对寄生虫免疫学的充分掌握，阐明宿主与寄生虫相互作用的免疫机制将继续给我们带来新的疫苗研制策略和新的靶抗原。寻找新的有效的候选抗原或通过优化组合成新抗原以及佐剂载体/传递系统的研究，以提高免疫保护作用是当前和今后寄生虫疫苗研究的热点。
7.4分子生物学技术
分子生物学与兽医寄生虫学的联系日益密切，寄生虫及宿主的分子生物学知识在兽医寄生虫学领域正变得越来越重要，分子生物学技术成为研究寄生虫不可或缺的技术[20]。应用寄生虫功能基因的常规分离技术(PCR技术、核酸探针、免疫筛选文库技术等)、高通量分离技术(DNA芯片／微阵列等技术)和特异基因筛选技术(消减杂交、差异显示、酵母双杂交系统、RNAi等技术)可分离、克隆与寄生虫生长、发育、入侵、致病、免疫逃避、期别、性别差异表达、耐药性等相关的功能基因，研究评估基因的生物学功能，为开发高效安全的抗寄生虫病疫苗提供基础。掌握寄生虫与其宿主的相互关系的分子生物学原理，应用基因组生物信息等工具为我们更快的成功防治动物寄生虫病提供了美好的前景。
总之，动物寄生虫病免疫预防的研究是一个非常现实与迫切需要探索的的问题。寄生虫基因工程疫苗的研制还有一段较长的路要走，相信随着基因、蛋白及免疫等方面的深入研究及分子生物学研究方法的不断改进，寄生虫基因工程疫苗的研究一定会突破难关，并最终成为寄生虫病防治的主要手段，对保障人、畜健康，推动畜牧业快速发展发挥重要作用。
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