盐酸克仑特罗残留量的测定方法

    1 范围
    本标准规定了可食性动物组织中盐酸克仑特罗残留量的测定方法。
    本标准适用于可食性动物组织中盐酸克仑特罗残留量的测定。

    第一篇  高效液相色谱法

    2 原理
    样品经有机溶机（甲苯+二氯甲烷混合液）抽提，提取液经酸性氧化铝小桩净化，洗脱液浓缩后用0.1mol/L盐酸溶解后供高效液相色谱仪进行检测。
   
    3 试剂
    除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
    3.1 酸性氧化铝（100-200目），层析用。
    3.2 甲苯
    3.3 二氯甲烷
    3.4 乙腈，色谱纯
    3.5 盐酸
    3.6 氢氧化钠
    3.7 磷酸二氧钾
    3.8 乙二胺四乙酸二钠
    3.9 盐酸克仑特罗贮备液：精密称取盐酸克仑特罗标准品，用0.1mol/L盐酸溶液配成100μg/ml，存放在冰箱中备用。

    4 仪器
    4.1 高效液相色谱仪，配有紫外检测器。
    4.2 旋转蒸发器
    4.3 匀浆机
    4.4 超声波发生器

    5 操作方法
    5.1 提取
    提取动物肝脏样品10.0g，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml(乙酸乙酯饱和)匀浆1分钟（2000rpm），超声5分钟，离心5分钟（400rpm），取上清液用40％NaOH溶液调节至pH12。加甲苯-二氧甲烷（3：1V/V）三次萃取（每次20ml），合并提取液。
    5.2 净化
    将提取液蒸发至约5ml，过酸性氧化铝小柱（直径1cm，长12cm），用0.1mol/L盐酸溶液洗脱待测成份，蒸干后用0.1mol/L盐酸溶液0.5ml溶解，0.45μm滤膜过滤后供高效液相色谱仪检测。
    5.3 色谱条件
    5.3.1 色谱柱，C18柱。
    5.3.2 流动相：乙腈：缓冲液[20mmol/L磷酸二氢钾+30μmol/L EDTA，Pμ3.9]（20：80V/V）
    5.3.3 流速：1ml/min。
    5.3.4 柱温：30℃。
    5.3.5 检测波长：243nm。
    5.3.6 进样量：20μl。
    5.4 测定
    根据样品液中盐配克仑特罗含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品液等体系参插进样测定。
    5.5 计算
                   X=A×Cs×V÷(As×m)
式中：X—试样中克仑特罗含量，mg/kg；
      A—液中盐酸克仑特罗的峰面积，μV.S；
      As—标准工作液中盐酸克仑特罗的峰面积：μV.S；
      Cs—标准工作液中盐酸克仑特罗的浓度，μg/mL；
      V—样液量终定溶体积，mL；
      m—最终样液所代表的试样量，g。
注：计算结果需将空白值扣除。±20％

    6 精密度和灵敏度   
    在上述色谱条件下，本方法的检测限为0.002μg/g，回收率为80％±20％。

    第二篇  气相色谱—质谱联用法

    7 原理
    样品用β—盐酸葡萄粮醛甙酶或芳基硫酸酯酶，在pH5.2的缓冲溶液中消化。萃取的组织样液通过离心和过滤分离。萃取液用C18和SCX小柱，固相萃取净化，分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。

    8 试剂
    8.1 乙酸铵缓冲液（20mmol/L，pH5.2）、溶解1.45g乙酸铵于500ml-700水中，用乙酸调整pH值至5.2并稀释到1升。
    8.2 β—盐酸葡萄粮醛甙酶芳或基硫酸酯酶溶液30U/ml或相当者。
    8.3 30mmol/L盐酸：30mL 1mo/L盐酸稀释到1升蒸馏水中。
    8.4 甲醇：分析纯。
    8.5 4％氨化甲醇（amonium methanol）：用甲醇稀释4ml氨溶液（比重0.88）至100ml。
    8.6 双三甲基硅基三氟乙酰胺，BSTFA。
    8.7 甲苯：分析纯。
    8.8 C18小柱：supelclean LC-18 Sep Pak 小柱500mg，3mL。
    8.9 SCX小柱：supelclean Lc-SCX SEP Pak小柱500mg，3L。
    8.10 标准溶液
    8.10.1 盐酸克仑特罗储备液：精确称取适量的盐酸克仑特罗标准品，用氨化甲醇配成浓度约1mg/mL的标准储备液。
    8.10.2 盐酸克仑特罗标准工作液：将储备液用氨化甲醇稀释为v(0.05-2.0) μg/ml，存放在冰箱中备用。

    9 仪器及设备
    9.1 离心瓶，50mL，具塞。
    9.2 Sep-Pak真空接头。
    9.3 具聚四氟乙和稀拧盖的试管。
    9.4 匀浆机。
    9.5 机械真空泵。
    9.6 旋涡混合器。
    9.7 恒温箱，精度为±3℃。

    10 操作方法
    10.1 提取
    准确称取已绞碎的动物肝脏样品（10±1.0）g，于50mL具塞的离心管中。加入20mmol/L的乙酸缓冲溶液20mL，均质5分钟。加入50μLβ-3000rpm离心5分钟，过滤上清液，收集滤液。
    10.2 净化
    装好真空泵和接管，将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL甲醇淋洗柱子，在溶剂流过固相萃取柱后，保持抽气5分钟使柱中的液体逐渐枯竭，取下C18柱，用5mL4％氨化甲醇淋洗SCX柱并收集流出液于具塞玻璃试管中。
    10.4 检测
    10.4.1 气相色谱条件
    10.4.1.1 色谱条件：HP-5MS5％苯基甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm(内径)。0.25μm（膜厚）；
    10.4.1.2 进样口：220℃；
    10.4.1.3 进样方式：不分流；
    10.4.1.4 进样体积：2μL；
    10.4.1.5 柱温：70℃（保持0.6分钟），以25℃/分钟升温至200℃（保持6分钟），以25℃/分钟升温至280℃（保持5分钟）；
    10.4.1.6 载气：氦气，流速：0.9ml/分钟（恒流）。
    10.4.2 质谱条件
    10.4.2.1 GC/MS传输线温度：280℃
    10.4.2.2 溶剂延迟：8分钟；
    10.4.2.3 EM电压：高于调谐电压200V；
    10.4.2.4 分析器温度：230℃；
    10.4.2.5 四级杆温度：106℃；
    10.4.2.6 选择离子监测（M/Z）86，243，262，277。
    10.5 测定
    根据样品液中盐酸克仑特罗含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品液等体积参插进样测定。
    定性：样品峰与标样的保留时之差不多于3秒，Q值应大于80，当Q值小于80时，应通过人工比较选择离子的丰度，以基峰百分数表示。
    10.6 计算

          X=h×Cs×V÷(Hs×m)
式中：X—试样中克仑特罗残留含量，mg/kg；
      h—样液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高，mm；
      Cs—标准工作液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高，mm；
      V—样液最终定容体积，mL；
      m—最终样注解所代表的试样器，g。
注：计算结果需将空白值扣除。

    11 精密度和灵敏度
    本办法的检测限为5μg/kg，回收率为80％±15%。

    第三篇  酶联免疫吸附法

    12 原理
    利用固相酶联免疫吸附原理，将盐酸克仑特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入稀释的尿样（未如抗原）及酶标盐酸克仑特罗抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显示色，颜色的深浅取决于抗体和酶标盐酸克仑特罗抗原结合的量，即样品中盐酸克仑特罗多，则被抗体结合酶标盐酸克仑特罗抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或仪器法与盐酸克仑特罗标样比较来判断样品中盐酸克仑特罗的含量。
 
    13 试剂和材料 
    除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
    13.1 盐酸克仑特罗酶联免疫试剂盒：德国R-Biopham公司生产或类似产品。
    13.2 50mmol/LHCL
    13.3 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH3.0
    13.4 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH3.0
    13.5 甲醇

    14 仪器与设备
    14.1 酶标测定仪，含有450nm的滤光片。
    14.2 水浴锅。
    14.3 微量连续可调移液器及配厌吸头：10μL-20μL。
    14.4 冰箱：（4-8）℃。
    14.5 离心机：0-10000rpm。
    14.6 超声波发生器。

    15 样制备
    15.1 均质：将5g粉碎的样品与25ml50mmol/LHCL混合，超声波处理10min，振荡30min均质；
    15.2 离心：称取6g均质物，4000rpm离心 15min，取上清液，加入300ullmol/LnaOH混合15min，加入4ml500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0），4℃保存1.5hr或过认，再次4000rpm离心15min，取上清液；
    15.3 PIDA C18柱纯化：先后用3ml甲醇洗涤柱子和2ml50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）洗涤柱子，样品进柱，再用2ml50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）洗涤柱子，正压去除残留流体并用空气吹干柱子，用1mll甲醇洗脱样品，蒸发溶剂，用0.4ml蒸馏水溶解干燥残留，取20μL进行分析（如样品浓压过高，用蒸馏水进行稀释）。

    16 测定步骤
    16.1 试剂盒和待检样品检测前平衡至室温（19-25）℃。
    16.2 每个微加入100μL稀释后的抗体溶液，充分混合并大骯室温孵育15min；
    16.3 倒出微孔中液体，250μL蒸馏水洗涤3次，拍干，加入20μL标准液或处理好的样品（标准和样品做两个平行实验），再加入100μL稀释的酶标记物，充分混匀，室温孵育30min；
    16.4 倒出微孔中液体，250μL蒸馏水洗涤3次，拍干，加入50μL基质和50μL空色剂，充分混匀，室温暗处孵育15min；
    16.5 加入100μL反应终止液，混匀后大骯酶标仪450nm处读吸光压值。

    17 结果计算
    17.1 计算标准品和样品的平均吸光值。
    17.2 以标准浓压和对数点钟横坐标，吸光值点为纵坐标绘制工作曲线。
    17.3 以样品吸光值大骯标准工作曲线上查出相对浓度，乘以样品稀释倍数，即为测定值。

    18 灵敏度
    本方法的检测限为100ng/kg。

    19 其他
    19.1 试剂盒应放在（4-8）℃冰箱内保存。
    19.2 为分析人员安全，操作时要戴止医用乳胶手套。