（浙江大学饲料研究所 农业部饲料与动物营养重点实验室，杭州310029）
摘要 应用细胞培养、结合放射免疫测定法探讨了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）对培养的大鼠腺垂体细胞分泌生长激素（GH）的影响。结果表明：在腺垂体细胞培养中，试验组（分别添加10－8、10－6、10－4M
NMDA）培养液的GH比对照组分别提高了67.92％、87.46％、100.67％差异显著（P<0.05）。试验表明NMDA能直接刺激离体腺垂体细胞分泌GH，并与NMDA呈剂量依赖关系。
关键词：N-甲基-D-天冬氨酸；细胞培养；腺垂体；生长激素；放射免疫测定法
The study of effect of N-methyl-D-aspartic acid （NMDA）on the growth
hormone secretion in the cultured anterior pituitary cell of adult
female rats
Li kui Xu zirong Feng jie
（Institute of Feed Science ,Zhejiang University ,the key Laboratoty
of Animal Nutrition and Feed of Chinese Agriculture Ministry
,Hangzhou 310029）
Abstract Applying the cell culture and radioimmuoassay，it is studied
the effect of N-methyl-D-aspartic acid on the growth hormone
secretion in the cultured anterior pituitary cell of adult female
rats in this article .In the same cell cultured medium,treated with
NMDA (0, 10－8、10－6、10－4M),the GH concentrations was greater
67.92%、87.46％、100.67％ in the experiemental group than in the control
group ，respectively.The difference is significant (p<0.05).It is
also shown that the various concentration of
NMDA(10－8、10－6、10－4M)can evoke secretion of GH directly，and the GH
response to NMDA was dose dependent.
Keywords： N-methyl-D-aspartic acid （NMDA）；cell culture；anterior
pituitary；growth hormone；radioimmunoassay
研究表明，适量的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）能显著促进腺垂体合成和释放生长激素（GH），提高血液中GH。NMDA的促生长效应与GH分泌增多有关，而其作用机理至今尚未定论，需进一步探讨。本试验应用细胞法和放射免疫测定法研究NMDA对雌性大鼠腺垂体培养细胞分泌GH的影响及可能作用机理。
1材料与方法
1.1动物 雌性Wistar大鼠，购自中国科学院上海试验动物中心
1.2试剂
N-甲基-D-天冬氨酸，DMEM培养液 ；5％胎牛血清 ；Hank’s液；胰蛋白酶；
鼠尾胶原 均购自美国Sigma公司产品 生长激素(GH)放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所
1.3仪器 CO2培养箱(日本产WJ-6L)； γ－免疫计数器（美国产Packard8500型）
1.4试验方法
取健康成年雌性Wistar大鼠10只，体重220+10g，于室温下隔离饲养，自由饮食、自然光照周期，一周后，在大鼠清醒状态下，用大剪刀将头剪断，于无菌条件下迅速剪开颅顶部皮肤，用止血夹去颅顶骨及颞骨，暴露大、小脑部。在前卤沿冠状面用无菌手术刀垂直切下，将脑游离出颅腔，从垂体窝中取出垂体，用眼科镊子分离出腺垂体。在超净工作台上将垂体倒入培养皿中，室温下将垂体在75％酒精中浸泡5s左右（灭菌），然后迅速转移到培养液中洗5～6遍，最后摘去中叶和后叶。将取出的腺垂体组织，置于盛有少量的DMEM培养液的平皿中，用剪刀将组织反复切割成碎块，然后把组织碎块连同液体注入离心管中，并补加少许培养液，用吸管吹打片刻置试管架3~5分钟，吸除上层液可排除非腺细胞成分，然后向离心管中加入沉淀量5～8倍的0.25％胰蛋白酶，在37℃水浴摇床中消化，每隔5～10分钟轻轻吹打一次，消化40分钟后吸取悬液经200目细胞筛过滤后，加入冷培养液终止消化，然后1000rpm离心10分钟，洗3～5遍，用含10％胎牛血清的DMEM液悬浮细胞并调整至105个细胞/ml，接种于24孔培养板（底部预先涂一层鼠尾胶原），置5％CO2，95％O2,温度为37℃的培养箱中进行培养。24小时后，换DMEM培养液，然后将腺垂体细胞培养液随机分成四组，其中第一组为对照组，加入10ul新鲜DMEM培养液，2、3、4组为试验组，分别加入1×10－8、、1×10－6、1×10－4M的NMDA，继续培养24h，将所有培养液，放入－20℃冰箱中保存待测。
1.5放射免疫测定
按试剂盒说明在美国产Packard8500型γ－计数器上测定取出的腺垂体细胞培养液中GH的含量。
1.6统计学处理
所有结果以x＋s表示，用国际通用的SAS6.0版（SAS institute Inc.1980）进行统计分析。
2试验结果
由上表可知，在培养48h后的腺垂体细胞培养液中，对照组GH含量为29.5+4.8ng/ml，试验组（10－8、10－6、10－4M
NMDA）中GH的含量分别为49.2+6.5、55.3+7.9、59.2+8.2ng/ml，与对照组相比分别提高了67.92％、87.46％、100.67％，差异显著（P<0.05），并且呈剂量依赖关系。
3讨论
上述试验结果表明：在腺垂体细胞培养中，试验组（分别添加10－4、10－6、10－8M
NMDA）GH含量比对照组分别提高了67.92％、87.46％、100.67％，差异显著（P<0.05）。这与Lindstrom等（1992）的试验结果一致。研究表明，GH是调节动物生长的关键因素，血清中的GH与猪的生长呈正相关。适量的NMDA可以显著腺垂体合成和释放GH，提高外周血GH水平。Estienne等（1996）报道，给阉割公猪静注2.5mg/kg体重NMA
血清GH水平提高了883％，5.0mg/kg体重NMA提高了1095％。Barb等（1993）观察了黄体期、卵泡期、去卵巢的猪腺垂体细胞添加NMDA对GH和LH释放的影响。试验发现黄体期和去卵巢期NMDA可以显著促进GH的分泌，并且能大大促进生长激素释放因子（GRF）的分泌，而在卵泡期却对GH的释放无影响，这提示NMDA对GH的释放与分泌可能与动物的繁殖有关。D’Aniello等（2000）在离体培养的腺垂体细胞中加入0.1mM
NMDA，与对照组相比，生长激素（GH）提高了近3倍（90.3+10.2vs31.6+5.5ng/ml），差异显著（p<0.01）。同时发现若向离体培养的细胞（垂体＋下丘脑），能大大促进GH的分泌与释放（150.4+20.4vs80.2+11.4ng/ml），这提示下丘脑对GH的释放也起重要的作用。Gay（1987）等试验发现，NMDA能显著促进下丘脑中GHRH的释放与分泌，这提示NMDA可能通过下丘脑调控GHRH的分泌，从而进一步促进生长激素的合成与分泌。NMDA对GH
的作用机理国内外报道不一，综合起来主要有以下几种主要观点：（1）NMDA刺激下丘脑GHRH的释放，GHRH再作用于垂体，促进GH的合成与释放
(2)NMDA直接刺激垂体细胞，促进GH
的合成与分泌（3）NMDA同时刺激下丘脑和腺垂体产生作用。本试验发现，离体培养的腺垂体细胞中，NMDA能大大促进GH的分泌，并且呈剂量依赖关系。这提示我们NMDA能够直接作用于腺垂体，促进GH的合成与释放。
参考文献
[1]C.Richard Barb John B.Barrett et al. [J] Life Science ,1993
,53:1157－1164
[2]M.J.Estienne ,W.F.Hurlock,and C.R.Barb [J].J Anim Sci, 1998,
76:2162－2168
[3]M.J.Estienne,J.M.Harter-Dennis,C.R.Barb et al[J] J Anim Sci
,1996, 74:597－602
[4]Gay.V.L,Plant.T.M. [J]Endocrinology ,1987 ,120:2289－2296
[5] D’aniello .M.M. Di Fiore,G.H.Fisher et al[J]FASEB J,2000,
14:699－714
[6]Lindstrom P,Ohlsson.[J] Endocrinology，1992，131：1903－1907
[7]Gemma D’aniello ,Achille Tolino et
al.[J]Endocrinology,2000,141：3862－3870
[8]Lee E.Claypool,Etsuko Kasuya,Youichi Saitoh [J]Endocrinology
,2000,141:219－228
[9]L.E.Claypool,E.Kasuya,Y.Saitoh,F.Marzban,E.Terasawa[J]Endocrinology
2000,141:219－228
[10]G.D’Aniello A.Tolino G.H.Fisher et al[J]Endocrinology, 2000,
141 :3862－3670
[11]L.Pinilla,L.Gonzalez,M.Tena-Sempere,C.Dieguez,E.Aguilar[J]Neuroendorinology
1999, 69:11－19
[12]Aaslan M,Pohe CR,Smith MS,Plant JM[J]Life Science 1992
50:295－300
[13 ] 郑志? 林玲 [M]科学出版社 2002
[14]冯杰 许梓荣 [J]中国兽医学报 2003 4 394－396
[15]许梓荣 卢建军 肖平 [J] 中国兽医学报 2001 21（6）631－633
