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细胞培养技术(2)

  作者: 来源: 日期:2003-01-01  
五、培养细胞形态分析

  培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异,最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的,结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时,细胞轮廓会增强,反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等,表明细胞代谢不良。

  六、培养用品的清洗与消毒

  目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿,清洗的主要目的为清除杂质和微生物,使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。

  (一) 清洗

  在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物,上次细胞残留物及非营养成分的化学物质,均能影响培养细胞的生长。因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗,且要根据器皿的组成材料不同,选择不同的清洗方法。

  1、玻璃器皿的清洗

  组织细胞培养中,使用量最大的是玻璃器皿,故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹,而且不能残留任何物质。

  (1)浸泡:初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿,在生产及运输过程中,玻璃表面带有大量的干固的灰尘,且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗,然后用稀盐酸液(5)浸泡过夜,以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质,干固后不易洗掉,故用后要立即浸入水中,且要求完全浸入,不能留有气泡或浮在液面上。

  (2)刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗,以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度,过度会损害器皿表面光泽度。

  (3)浸酸:清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成,其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用,而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液,勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜,不应少于6小时。 清洁液可根据需要,配制成不同的强度,常用的下列三种: 重铬酸钾(g) 浓硫酸(ml) 蒸馏水(ml) (A)强清洁液 63 1000 200000 B)次强清洗液 120 200 1000 (C)弱清洁液 100 100 100

  清洁液配制时应注意安全,须穿戴耐酸手套和围裙,并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

  (4)冲洗:玻璃器皿在使用后,刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作,则需流水冲洗十次以上,每天水须灌满及倒干净,最好用蒸馏水清洗3-5次,晾干备用。

  2、胶塞的清洗

  细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质,应先用自来水冲洗,再做常规处理,常规清洗方法是:每次用后立即置入水中浸泡,然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟,以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后,再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟,晾干备用。

  3、塑料制品的清洗

  塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装,打开包装即可用,多为一次性物品。必要时用2% NaOH浸泡过夜,用自来水充分冲洗,再用5%盐酸溶液浸泡30分钟,最后用自来水和蒸馏水冲洗干净,晾干备用。

  (二)消毒

  细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌,真菌和病毒等微生物的污染,污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常见的原因有操作间或周围空间的不洁,培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底,由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规,防止发生污染。

  消毒方法分为三类: (A) 物理灭菌法(紫外线、湿热、过渣等)。 (B) 化学灭菌法(各种化学消毒剂)。 (C) 抗生素。

  (1)紫外线消毒:用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好,经一定的时间照射后,可以消灭空气中大部分细菌,培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米,且消毒进物品不宜相互遮档,照射不到的地方起不到消毒作用。

  紫外线可产生臭氧,污染空气,试剂及培养液都有不良影响,对人皮肤也有伤害,不宜近照射也进行实验操作。

  (2)温热消毒:即高压蒸气消毒,是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时,消毒物品不能装得过满,以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险,保证其内气体的流通。在加热升压之前,先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气,冷气空气排出后,关闭排气阀门,同时检验安全阀活动自如,继后开始升压,当达到所需压力时,开始记算消毒时间。消毒过程中,操作者不能离开工作岗位,要定时检查压力及安全,防止消毒及表皮意外事件发生。

  常用物品消毒压力及时间:

  培养液、橡胶制品、10磅10分钟;

  布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。

  上两种是最常见的物理消毒方法。

  (3)化学消毒法:最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭,前者主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

  (4)抗生素消毒:确切应记成抗生素灭菌,主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

  

 
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