尽管最常用的DNA疫苗剂形是将DNA疫苗溶于生理盐水，直接免疫动物即可产生较好的免疫反应，但同时也有许多研究表明，联合使用某些佐剂可以增强DNA疫苗的免疫效果，而且某些佐剂能调节免疫应答的类型。
（一）、细胞因子、趋化因子和共刺激分子（cytokines, chemokines and costimulatory molecules）
随着研究的不断深入，越来越多的细胞因子被人们发现和了解，迄今为止，人们已经发现了近几十种细胞因子[51]。由于细胞因子一般比较昂贵，因此以纯化细胞因子作为佐剂尚不多见，但是随着DNA疫苗技术的出现，人们可以将携带细胞因子的真核表达质粒导入体内，使相应的细胞因子在体内得以表达，从而使得细胞因子作为佐剂使用得到快速发展。但是禽类细胞因子的研究远远落后于哺乳动物，目前仅发现了8种禽类的细胞因子，其中包括IL-1β、IL-2、IL-8、IL-15、IFN-α、IFN-γ、TGF-β4和lymphotactin [52], 因此在禽类以细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究还比较少。Lillehoj等[52]以鸡艾美尔球虫3-1E基因（pcDNA 3-1E）免疫为模型研究了上述8种鸡细胞因子对DNA疫苗的佐剂作用。1μg IFN-γ和10μg lymphotactin表达质粒与pcDNA 3-1E联合免疫，可显著增强抗球虫病的保护率。分别将10μg IL-8、lymphotactin、IFN-α、IL-15、TGF-β4、IL-1β与pcDNA 3-1E联合免疫可明显降低球虫的复制，增强了免疫效率。流式细胞术检测表明共注射IL-8或IL-15表达质粒的pcDNA 3-1E与单注射pcDNA 3-1E相比，十二指肠上皮细胞中CD3+细胞比例下降，而共注射其它细胞因子的DNA疫苗都增加了CD3+细胞比例。Vanrompay等[53]将火鸡γ-干扰素基因克隆入pCI-neo载体构建成pCIneo-IFN-γ，探讨了对禽类血清A型衣原体的外膜蛋白（MOMP）基因免疫的影响。结果发现共表达火鸡IFN-γ组对衣原体的攻击保护率达80%，明显增强了免疫效果。这些结果都提示细胞因子可以作为禽类DNA疫苗的优良天然免疫佐剂。
在哺乳动物DNA疫苗的研究中，也广泛使用趋化因子（如：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3等）和共刺激因子（如：CD80、CD86、CD40等）作为免疫佐剂[50]，但是在禽类尚无类似报道。
（二）、化学佐剂
在哺乳动物DNA疫苗的研究中，脂质体，免疫刺激复合物（ISCOM）、生物可降解微球(biodegradable microsphere)、磷酸钙等都显示出作为佐剂的良好应用前景。脂质体是一种人工合成的浓缩磷酸脂双分子层小颗粒。作为佐剂有以下优点：生物体内可降解、无毒、免疫惰性、容易制备以及组分可以调整，能获得很高的免疫效价。其中阳离子脂质体/DNA混合物比阴离子及中性脂质体能更为有效地转染不同类型的组织和细胞类型，且能够携带大片段DNA分子（≥250 kb）进入细胞, 但是具体机制尚不清楚[45]。ISCOM是胆固醇、磷脂及QuilA混合形成的一种稳定的笼状复合物，其增强免疫应答的机制可能是由于其体积小，具有亲水性而易于被APC吞噬[54]，由ISCOM诱导的免疫反应以Th1型为主。所谓的生物可降解性微球是指由一些在生物体内可降解的高分子聚合物组成的直径在1-200 μm之间的颗粒，它的作用是将抗原或DNA疫苗包裹在其中，在体内随着降解而慢慢释放，从而诱导长期的免疫反应[55]。在禽类DNA疫苗的研究中，除了脂质体外，其它如ISCOM和生物可降解微球尚未有报道。Suarez等以带有禽流感HA基因的pCI-neo-HA质粒为模型，比较了蔗糖、二氨基右旋糖苷、磷酸钙、聚凝胺和两种不同的脂质体对DNA疫苗的影响，结果发现两种阳离子脂质体都能提高抗体水平和增强保护率, 但其他佐剂反而降低了抗体水平。Sakaguchi等以脂质体为佐剂制备新城疫病毒DNA疫苗，结果发现免疫5只鸡中有4只出现了高水平的抗体，免疫后9周，攻击NDV强毒株，结果发现产生抗NDV F蛋白抗体的免疫鸡能保护致死性NDV的攻击，而裸质粒对照组仅有2只鸡出现了中和抗体，这表明，阳离子脂质体具有很强的佐剂作用。
（三）、CpG序列
在哺乳动物中，CpG基序已经被证明是一种强烈的非特异性免疫刺激剂，CpG DNA可促进机体内建立Th1型为主的免疫应答，诱导IL-12、INF-γ等细胞因子的产生。国内孟树松等首次将富含CpG序列的细菌DNA和ILTV DNA疫苗联合免疫SPF鸡，结果发现CpG DNA 增强了胸腺、法氏囊淋巴细胞的增殖活性和血清抗体水平，攻毒后的存活率从79%提高到86%，这提示CpG序列也可作为禽类DNA疫苗的一种优良佐剂。
五、影响DNA疫苗免疫应答的因素
影响DNA疫苗应答的因素很多，比如载体本身的情况，不同的接种方式，接种剂量、宿主的差异等均可能对免疫应答的强度及免疫应答的类型造成影响。
（一）、载体本身的因素
对于载体本身而言，启动子强弱是决定免疫应答强度的最主要因素，这在前面部分已经进行了讨论。由于DNA疫苗载体由细菌质粒DNA衍生而来，而细菌的DNA中富含CpG基序，因此，载体序列中CpG基序的有无及数量多少也成了影响免疫应答的因素。此外，质粒的存在形式也可能会对免疫应答造成影响，例如仅有的一篇研究报道表明，将NDV F基因克隆入CMV极早期启动子和鸡β肌动蛋白基因启动子的下游，构建NDV DNA疫苗，环状质粒DNA肌肉接种1周龄小鸡并不能诱导产生针对F蛋白的抗体，也没有任何保护效果，而线性化质粒DNA免疫后的5只鸡有4只产生了高水平的抗体，并能保护强毒株的攻击。而在其他所有的研究中使用的都是高纯度的超螺旋质粒DNA进行免疫。
（二）、接种途径及佐剂
不同的接种途径不仅会影响DNA疫苗激发的免疫应答的强度，而且也会影响免疫应答的类型。Pertmer等研究发现，肌肉接种主要产生Th1型免疫应答，而基因枪免疫则主要产生Th2型免疫应答。使用不同的佐剂也会产生不同的免疫应答。一般认为，IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CpG序列、ISCOM等可以使免疫应答向Th1方向发展，而IL-4、IL-6、IL-10等则可使免疫应答向Th2方向发展。此外，同时接种多种质粒时，虽然不一定改变免疫应答的强度，但是可能会使免疫应答的类型发生改变。比如小鼠皮内接种表达人流感病毒HA基因的DNA疫苗，一般产生Th1型免疫应答，而BHV-1gD编码质粒产生Th2型应答, 当将两种质粒同时接种时，则使针对两种抗原的免疫应答同时向Th2方向发展。
（三）、免疫剂量和免疫程序
根据不同的接种途径及动物的种类，不同试验中所使用的质粒DNA的差异很大，单次接种剂量，最少的为0.25μg, 最多为750μg。在大多数研究中，免疫反应的强度都与免疫剂量呈正相关。但是，Suarez 和Schultz-cherry的试验中，当用100μg剂量进行肌肉接种时可获得较好的免疫效果，当用较大剂量时，免疫效果反而下降。
在禽类DNA免疫程序中，一般都是在1周龄以内进行首免，然后再进行1-2次增强免疫，但是大部分的研究表明，只有在加强免疫后才会取得较好的免疫效果。
