[摘要] 介绍了DNA疫苗在动物试验研究方面的现状，如：动物免疫试验中动物模型的选择、疫苗的接种途径及其选择、免疫学效果评价、安全性评价和DNA疫苗研究存在的问题，以及DNA疫苗在控制畜禽疾病方面的应用前景、发展趋势。
[关键词] DNA疫苗 动物免疫试验
DNA疫苗是将含有编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的[1]。具体的讲，DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA，经直接接种体内后，可被体细胞摄取，并转录、翻译、表达出相应的抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答[2]。DNA疫苗由于不需要任何化学载体，又称为裸DNA疫苗。
DNA疫苗以核酸形式存在，这种核酸既是载体又能在真核细胞中表达抗原。DNA疫苗的这一特性，使其与传统疫苗及基因工程疫苗等不同而被认为是一类特殊的疫苗。由于DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又兼备只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的诱导细胞免疫应答的特点，因而越来越受到重视。本文介绍了DNA疫苗在动物试验研究方面的情况。
1 动物免疫试验
1.1动物模型的选择
到目前为止，用于开展DNA疫苗试验的动物模型包括鱼、鸡、小鼠、大鼠、家兔、猫、狗、雪貂、牛、猪以及非人灵长类动物等。选择动物模型时该考虑以下几点：①对于一些用于动物性疾病预防和治疗的DNA疫苗，可以直接用相关动物进行试验，如鸡新城疫病毒的DNA疫苗直接使用鸡作为实验动物；②对于用于预防或治疗人类或较大动物疾病的DNA疫苗，可以首先使用小动物开展最初的动物试验，目前用于人类的一些DNA疫苗大多以小鼠为动物模型进行最初的试验，并取得了较好效果；③选用动物模型时应该选择对病原体较为敏感，能够产生相应病征指标甚至死亡的动物，从而能够更好地评价DNA疫苗的效果；④在动物试验中发现，一些DNA疫苗在小鼠体内能够诱导产生较强的体液免疫或细胞免疫反应，但是当使用较大动物开展同种DNA疫苗试验时，动物的个体越大，免疫反应的效果越差。因而在开展动物试验时，在小动物上获得的试验结果需要进一步扩展到较大动物。
1.2 DNA疫苗的接种途径及其选择
⑴肌内注射 目前大多数研究者认为，横纹肌系统是最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织。肌肉组织具有安全、体积大、免疫接种容量大的优点，因而常被用来进行DNA免疫注射。
质粒DNA载体进入肌组织后，在肌纤维外的间质内扩散。影响扩散的主要屏障是肌束膜。
目前对DNA免疫过程中肌纤维对外源质粒摄取的具体机制尚不太清楚。Davis等[3]研究发现，预先注射心肌毒素使肌纤维处于再生状态，有利于质粒DNA的摄取，而单核的未成熟肌纤维则无摄取质粒DNA的功能。表明只有当肌纤维分裂处于多核状态时，肌纤维分化形成T小管系统后，才能摄取外源DNA。
肌细胞摄取DNA后可对外源DNA进行持续的表达。Wolff等(1990年)将编码β-半乳糖糖苷酶的报告基因注入小鼠后腿肌中，经组织化学染色发现，注射区约有10-30%肌纤维染成蓝色，纵向染色深度可达400um，说明肌纤维可以摄取并表达外源基因产物。表达量及其活性同DNA呈剂量依赖关系，有报道基因可持续表达19个月以上。定量PCR检测发现，大多数质粒DNA载体可以在肌纤维内稳定持续存在和表达。此外，肌细胞合成分泌的外源抗原与产生的特异性抗体可以形成抗原抗体复合物，并沉积于树突状细胞表面，长期释放抗原，诱导产生记忆性T、B细胞[4]。
肌内注射免疫在DNA疫苗的研究中获得了广泛的应用，对DNA疫苗的最初研究便是利用了肌肉接种这种方式。赵连三[5]、Straford等[6]研究小组分别在HIV、HBV、流感病毒和破伤风杆菌DNA疫苗的研究中使用了肌肉接种的免疫方式，从他们的研究结果来看，肌肉细胞能够吸收表达质粒，有效地表达病原体抗原蛋白，并诱导免疫反应的产生。
⑵皮内或皮下注射 基因枪介导的皮内或皮下导入、局部皮肤表面涂布DNA疫苗与肌内注射相比，尽管皮内或皮下免疫转染率较低，但较高的转染率并非是决定免疫效果的唯一因素。由于皮肤组织代谢较快可导致外源基因产物的表达为一过性。但该部位具有很多抗原递呈的细胞，通常只需要极少量的DNA疫苗即可诱发长时间的保护性免疫[7]。
利用PowderJect系统进行皮下或皮内免疫的方法已经应用到人体。Roy等[8]利用强力喷射系统将包裹了乙肝病毒（HBV） DNA疫苗的金颗粒导入皮肤细胞，结果不仅能诱导产生特异的保护性抗体，而且还能诱导细胞免疫反应。PowderJect制药公司的科研人员也利用该系统进行HBV DNA疫苗的皮内导入，结果能够诱导对常规HBV疫苗无反应志愿者中50%的人体内产生特异免疫反应，对于低反应者则有80%的人体内产生足量的抗体。上述的研究结果均表明皮下或皮内导入免疫是一种非常有效的方法。
为了获得较好的免疫效果，通过皮肤局部涂布一般应考虑于免疫前去除皮肤上的角质层细胞。Liu等[9]使用快速黏离法去皮肤上的角质层细胞，然后皮肤局部共同涂布免疫HIV DNA疫苗和细胞因子表达质粒，结果诱导小鼠体内产生了高水平的特异体液免疫和细胞免疫。Watabe等[10]也在去除局部皮肤角质层细胞后将流感DNA疫苗通过皮肤局部涂布的方法免疫小鼠，结果也同样取得了较好效果，诱导小鼠体内产生了特异的体液免疫反应和细胞免疫反应。
⑶鼻内滴注及鼻腔喷雾 粘膜是预防大多数病毒、细菌入侵的第一道屏障，在免疫预防中具有重要作用。Tadokoro等[11]考查了鼻内接种DNA疫苗后的组织定位和表达动力学，接种后2-4个星期进行的荧光原位杂交检测表明在肺、肝、肾、脾、局部淋巴结，胚胎和食道中均检测到质粒的存在，在肺、肝和脾中能够检测到特异的mRNA，而在肺部能够检测到特异蛋白，上述研究结果为解释通过鼻内接种能够诱导较强的免疫反应提供了重要信息。
Cohen（1993年）通过鼻内滴注含编码流感病毒抗原的质粒DNA载体，来预防呼吸道病毒的感染。Okada等（1997年）向小鼠鼻内滴注含编码HIV-1抗原的DNA载体，结果在小鼠体内诱导产生了高水平的体液免疫和细胞免疫反应，在排泄物及阴道分泌物中均可检测到粘膜分泌型IgA，研究结果表明鼻内接种的方式能够诱导有效的中和抗体产生。
⑷其他免疫途径 包括口服、阴道接种、静脉注射及腹腔注射等。静脉注射质粒DNA表达载体，可使包括肺、脾、淋巴结、骨髓等在内的几乎所有组织发生转染，其中肺、脾外源基因表达率最高。腹腔注射质粒DNA表达载体，可转染脾脏中T淋巴细胞及骨髓来源的造血干细胞。以上几种免疫途径均未发现对机体有何毒性损害。
1.3 DNA疫苗的接种方案
由于多数DNA疫苗在体内表达量低，持续时间长，因而DNA疫苗在动物和临床试验中往往需要多次免疫接种[2]。实验已经证明多次加强免疫在小动物试验中能够增强免疫反应，获得较为理想的免疫效果。另外，也可以采用DNA疫苗免疫与其他类型疫苗匹配进行免疫的策略。Ramsay等（1999年）提出初次免疫使用DNA疫苗进行肌内接种，然后用重组痘苗病毒疫苗加强免疫，发现能够显著提高特异的CTL反应，并能增强清除感染和抗攻击能力。
1.4 DNA疫苗的免疫学效果评价
DNA疫苗接种后是否能诱导有效的免疫应答是评估DNA疫苗构建是否成功的关键指标，也是决定能否继续开发研究的主要因素。DNA疫苗免疫效果主要从以下三个方面来加以评价：
1.4.1体液免疫反应效果评价
体液免疫的评价指标主要是实验对象的特异性血清阳转率、血清抗体滴度、粘膜分泌型IgA抗体滴度、B细胞功能以及间接反映体液免疫应答的细胞因子水平等。
在抗体滴度测定中常用的方法有：免疫酶分析技术（包括酶联免疫吸附法、生物素－亲和素系统法、生物素－链霉亲和素系统法、酶联免疫荧光法、斑点或斑点免疫结合试验），免疫荧光技术（包括经典免疫荧光分析技术和时间分辨免疫荧光测量技术），放射免疫分析法，免疫组织化学技术，免疫印迹法以及各种经典的病毒、细菌血清学试验（包括中和试验、凝集试验、空斑形成抑制试验、血凝抑制试验和沉淀试验等）。
B细胞功能测定的主要指标有：B细胞增殖试验；抗体生成细胞数测定（包括B细胞内抗体生成能力的测定及B细胞溶血空斑试验）。
细胞因子检测的主要指标有：IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等参与B细胞介导免疫应答的细胞因子的含量。
1.4.2细胞免疫反应效果评价
评价细胞免疫的主要指标包括T细胞功能测定，NK细胞活性测定以及间接反映细胞免疫应答状况的细胞因子检测。
T细胞功能测定的主要方法有：T细胞增殖反应试验（包括3H-TdR搀入法和MTT法）和细胞毒T细胞的功能测定，包括51Cr释放法、3H-TdR释放法和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验等。
NK细胞活性测定主要采用形态观察法，核素释放法和LDH释放法。
细胞因子检测的主要指标有：IFN-γ和IL-2的含量测定。
1.4.3保护率的测定
保护率是一个反映机体免疫应答的综合指标，也是体液免疫应答与细胞免疫应答协同作用的结果。保护率测定的基本步骤是：①接种疫苗；②病原体攻击；③免疫保护率测定（包括相对保护率和绝对保护率）。
2 DNA疫苗的安全性评价
DNA疫苗的安全性评价对于发展候选疫苗具有重要意义[2]。要将体内与体外的所有实验数据汇总后来评价该疫苗是否足够安全。包括疫苗所诱导产生的免疫类型、局部接种免疫病理学特征、持续时间、免疫途径、免疫次数等都是考查对象。使用动物进行试验必须要符合实验室操作规范(GLP)，另外选择动物模型要具有针对性，一些非传统动物模型对于某些疫苗的研究具有特殊意义，同时，直接来自本动物的实验数据更是不可或缺的。
2.1局部反应和系统毒性研究
评价系统毒性的研究必须与局部反应的评估研究相结合。评估报告应该包括以下内容：潜在的靶器官毒性（包括造血系统及免疫系统）、病理和组织病理以及总的评价。局部反应的研究应该包括来源于注射部位组织活检或尸检报告的详细资料。另外评估试验的内容还应包括疫苗接种后在组织中特异性的分布情况，疫苗在宿主细胞存在及表达的持续时间及强度。考查的内容还包括DNA疫苗中含有的细菌蛋白污物能否诱导产生相应的免疫反应。
2.2遗传毒性研究
质粒DNA整合到机体基因组上在理论上是有可能的，质粒DNA的整合将有可能活化癌基因，同时抑制抑癌基因，从而导致插入突变；另外质粒DNA的插入还会导致染色体不稳定，发生断裂和重组。评价重组可能性的研究应将重点放在质粒DNA是否会与内源性的宿主DNA发生重组，设计试验时要使用最敏感的检测方法，例如使用PCR法来检测其组织分布性.
疫苗接种后，要对疫苗的分布进行定位。在可能的情况下，对预期的接种途径（如皮下、肌内、鼻内及血管内）都要进行测试。要用最敏感的方法对质粒DNA在接种部位及末梢组织中的存在进行检测和评估。
DNA疫苗过量表达的抗原产物也应引起重视。超量表达可能会对免疫系统产生异常的活化作用，发生急性或慢性炎症反应，导致自身免疫反应和正常组织受损。
2.3生殖毒性研究
质粒DNA疫苗有可能迁移到机体性腺组织，可能使生殖细胞发生变异。因而有必要使用PCR法检测来源于同胎的雌性及雄性动物性腺的DNA样本。如果所使用的DNA疫苗有可能影响到机体妊娠和胚胎发育等生理过程，就要进行进一步研究，这在人的药品开发中尤为重要。
2.4肿瘤发生相关性研究
如果研究的结果显示DNA疫苗具有整合活性和广泛的组织分布或者出现了危险的慢性表现，就应对该疫苗肿瘤发生的可能性进行评估。主要的研究焦点是质粒DNA载体是否与机体基因组有着广泛的同源序列，载体上是否包含有已知潜在致瘤性的序列。
2.5疫苗佐剂和接种设备的安全性评价[12]
对于需要使用免疫佐剂的接种方案，应该开展相应的临床前研究以确保这种组合的安全性。对于那些还未获得许可的佐剂和简化免疫方案的特殊组合也需要获得许可。
3 DNA疫苗研究中存在的问题
目前DNA疫苗研究取得了重大进展，DNA疫苗运用到动物模型上已经取得了较好的效果，而且几乎在所有的动物试验上并未发现有任何副作用。但是还有很多的问题需要解决，如疫苗的质量控制、质量标准及安全性等。其中最为重要的是安全性问题[13]，主要有以下几个方面。
3.１ 质粒ＤＮＡ可能诱导自身免疫反应 尽管人和动物的许多试验表明质粒ＤＮＡ诱发自身免疫性疾病的可能性较小，而且目前已有一项ＤＮＡ疫苗的接种研究表明，免疫动物血清中未检测到抗ＤＮＡ抗体，但在ＤＮＡ疫苗试验时，仍应进行抗ＤＮＡ抗体的检测。
3.２ 持续表达外源抗原可能产生一些不良后果 质粒长期过高水平地表达外源抗原，可能导致机体对该抗原的免疫耐受或麻醉。在成年动物，尚未见到因ＤＮＡ疫苗接种而诱发免疫耐受的例子。但新生动物的免疫系统尚未成熟，可能将外源抗原认为是自身成分而形成耐受。另外，持续低水平表达的抗原可能会被血中的中和抗体清除，不能引起足够的免疫应答，从而使疫苗的预防作用得不到充分的体现。
3.３ 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取，反复用ＰＣＲ技术检查血中质粒，结果为阴性，揭示肌注后逸入血流的疫苗质粒数量是微不足道的，质粒去向如何尚待进一步阐明。
3.４ 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，目前已知的主要有载体设计、核酸疫苗的导入方法、佐剂及辅助因子会对其免疫效果有影响。另外年龄和性别因素、肌注剂量和体积、预先注射蔗糖溶液等都会对肌注质粒ＤＮＡ的表达有影响。
3.５外源ＤＮＡ注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞，这也许是核酸疫苗的诸多安全性问题中最值得深入研究的地方。Whalen等认为：通常用于实验核酸免疫的剂量（100ug质粒）相当于1013拷贝，当注入肌肉后，绝大部分被降解和清除，但此问题仍待进一步研究证明。
4 DNA疫苗在畜禽疾病控制中的应用前景与发展趋势
目前，随着人们对DNA疫苗的研究日益深入，在人用DNA疫苗的研究方面已取得了巨大的成功。美国ＦＤＡ已批准乙肝疫苗等１０余种ＤＮＡ疫苗进入临床试验，其中艾滋病和Ｔ细胞淋巴瘤的核酸疫苗已进入了临床前阶段，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等核酸疫苗也正处于研究阶段。
而在动物用DNA疫苗的研究方面，与人用DNA疫苗存在着很大的差距，大多还仅仅处于实验室的研究阶段。目前，动物用DNA疫苗的研究主要还集中在对养殖业威胁严重的传染性疾病上[14]，目前已开展研究并取得一定实验室结果的病原有：禽流感病毒(AIV)、 鸡新城疫病毒(NDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(AILTV)、 鸡传染性支气管炎病毒(IBV) 、鸭乙肝病毒(DHBV)、 伪狂犬病病毒(PrV)、口蹄疫病毒(FMDV) 、猪呼吸及繁殖综合征病毒(PRRS)、猪流感病毒(SIV) 、牛疱疹病毒(BHV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) 、牛环形泰勒虫、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫白血病病毒(FeLV) 、犬细小病毒(CPV) 、狂犬病病毒等，但是这一切从研究到田间实验、区域试验和批准为正式产品，似乎还有很大的一段距离。
关于DNA疫苗免疫佐剂方面的研究正在发展，已经发展起来的DNA疫苗不仅只是使用DNA，而且还包括一些附加物，它有助于DNA进入靶细胞，或者起到佐剂的作用，以增强免疫应答。
除了原有的免疫途径如肌肉、表皮、粘膜和静脉等组织器官外，还有新免疫途径的发现。例如，利用减毒的细菌作为载体将DNA疫苗导入体内和直接注射到局部淋巴结或脾脏等新的接种方法均取得了较好的效果。质粒DNA的接种剂量，接种途径及接种程序等方面的研究也将是下一步的热点。
在２１世纪，随着分子生物技术的不断发展以及人们研究的不断深入，相信DNA疫苗必将会为人类和动物的健康做出巨大贡献，必将成为人类和动物与各种疾病抗争的有利武器。
