转基因植物疫苗研究现状及进展

    转基因植物疫苗作为一种口服疫苗，具有十分广阔的应用前景。本文从转基因植物疫苗的优点、转基因植物疫苗的应用前景、转基因植物疫苗的制作流程、转基因植物疫苗的作用机理、已获得的转基因植物疫苗等方面进行了论述。最后对转基因植物疫苗现存的问题进行了分析并提出了相应的解决方案，以促进转基因植物疫苗更好地服务于畜牧业生产。

    接种疫苗是目前控制疾病传播最有效的方式。传统疫苗在预防疾病的传播中发挥了重要作用，但因其生产成本较高、接种方式复杂及潜在安全性等问题，存在着许多不尽如人意的地方。口服疫苗能有效地诱导黏膜免疫，而且以口服途径给药，避免了注射疫苗所带来的安全问题，因此，口服疫苗是未来疫苗发展的方向。口服疫苗主要包括菌苗、病毒疫苗、蛋白质亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗及转基因植物疫苗等。转基因植物疫苗由于具有生产简便、成本低廉、安全性好、可食用等优点越来越受到人们的青睐。转基因植物疫苗的优点

    与传统疫苗相比，转基因植物疫苗具有突出的优点：①生产成本低，可直接供人服用或饲喂动物，不需要分离提纯。②易于保存。转基因植物疫苗常温下就可以保存，无须冷藏保存，生产过程也无须严格无菌条件。③具有更好的免疫原性。植物细胞的全能性及其完整的真核细胞表达系统使抗原蛋白保持了自然状态下的免疫原性，而目前医药生产常用的微生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后加工，往往导致其免疫原性变弱。④比传统的免疫途径更安全。转基因植物疫苗不需要注射器和针头之类的设备，避免由于消毒不严格而通过注射器和针头传播疾病的可能。⑤比传统的免疫途径更有效。植物细胞壁的存在可以抵抗胃酸、胰蛋白酶以及其他消化酶对抗原蛋白的直接消化，使其在小肠中逐渐释放，利于激起较强的黏膜免疫反应，达到免疫的目的。⑥应用范围广，易于推广。转基因植物疫苗不仅可以直接应用于人，而且可以通过添加到饲料中饲喂家畜和野生动物，以达到免疫的目的。

    转基因植物疫苗的应用前景

    转基因植物疫苗除了可以用来防止传染性疾病的入侵外，还可以用于非传染性疾病的治疗。如利用免疫反应来消灭异常发育的细胞、恶性肿瘤或减少炎症对特定器官的危害等。

    转基因植物疫苗可以治疗自身免疫疾病

    将CTB2-胰岛素原基因在马铃薯中融合表达并喂食非肥胖性糖尿病(NOD)鼠，结果表明，实验小鼠体内胰岛炎症减轻，这说明了喂CTB-胰岛素原诱导的免疫耐受能够减轻这种T细胞介导的细胞毒素引起的自身免疫疾病。

    转基因植物疫苗可以用来治疗癌症

    Stoger等人于2000年首先成功克隆出了一个与肿瘤相关的标志性抗原——癌胚抗原(c EA)的单链Fv抗体(Sc Fv T84.66)。经过基因重组使单链Fv片段的结构的靶标为植物细胞的质外体的内质网并在小麦和水稻的叶和子粒中得到表达，其生物活性在干种子储存5个月后无明显变化，小鼠口服后表现出明显的抗肿瘤作用。Warzecha等人2003年将Ⅱ型人乳头瘤病毒(humanpapilomavirusvirus，HPV)的L1基因转入马铃薯，当大鼠摄入含L1基因的马铃薯后，激活了小鼠潜在的保护措施并引起体液免疫应答。这些事例表明利用植物诱导仅存在于癌症细胞中的特殊肿瘤抗原，然后让动物口服，可以在一定程度上降低癌症的发病率。

    转基因植物疫苗可以用来控制哺乳动物的生殖

    哺乳动物受精过程中精卵细胞的结合具有种属特异性，这种特异性的结合是由精子表面的特异性蛋白与卵细胞透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的。透明带是卵细胞膜外的一层非细胞结构，是精子与卵细胞识别和结合的部位，透明带具有多种糖蛋白，其中ZP3充当精子受体在受精过程中起着重要作用，而从避孕的角度来说，它是免疫避孕的一个靶位。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含有13个氨基酸残基的抗原决定簇转化到烟草花叶病毒的衣壳蛋白中，利用其作载体感染植物获得了转基因植物，用此转基因植物免疫小鼠，其体内产生了抗ZP3的特异性血清，还发现透明带聚集了抗ZP3抗体，证明利用转基因植物生产避孕疫苗具有可行性。

    转基因植物疫苗控制各种传染性疾病

    迄今为止，已成功在植物中表达乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因、大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)基因、狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)基因、口蹄疫病毒VPl基因、轮状病毒基因等，通过口服后产生了明显的免疫效果。Turpen等将编码疟原虫抗原决定簇的基因片段插入到烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的编码区中，构建了植物病毒载体，然后用它感染烟草，所产生的高水平重组融合蛋白经试验证明具有抗原活性，这表明通过转基因植物控制各种传染性疾病是可行的。

    转基因植物

    疫苗的制作流程

    目标抗原的选择

    当一些亚单位疫苗的结构比较清楚时，可以直接用植物表达系统来表达这些疫苗；如Mason等于1992年采用农杆菌LBA4404介导的方法在烟草中成功表达重组乙肝病毒表面抗原(HBs Ag)。但是当要表达疫苗的抗原尚不清楚时，就要对病原微生物的毒素亚单位结构或表面抗原进行筛选。对于一些尚不明确的病原微生物，可以先通过基因组学或蛋白质组学的方法来进行抗原的筛选。在进行疫苗制备时，一般选择病原体表面糖蛋白编码基因，因此要明确编码具有免疫活性的特定抗原的DNA，而对于易变异的病毒则可选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因序列。

    受体植物的选择

    选择合适的受体植物是生产转基因植物口服疫苗的关键。合适的受体植物可以使转基因植物口服疫苗兼具表达量高、耐储藏和适宜口服等优点。植物的新鲜组织(植物的叶片、幼苗、水生植物的叶片)和干燥组织(谷物的种子)都可以用来表达口服疫苗。但植物新鲜组织中的蛋白在新鲜组织被采收后很容易被降解，需要立即加工处理，而植物干燥组织中的蛋白在脱水状态下无须进行加工处理能够长期储存，因此利用植物的干燥组织表达口服疫苗在实际生产中的应用更广泛。

    玉米种子蛋白质含量高，可以对重组蛋白进行高效表达，而且玉米在常温下能够长期储存，是多种畜禽饲料的主料，所以玉米是一种比较理想的畜禽口服疫苗表达受体，而且LT—B(大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位蛋白)和TGEV(猪传染性肠胃炎病毒疫苗)在玉米中已实现了高效表达；进一步的研究发现，玉米种子中表达Derpl抗原是安全的。此外，马铃薯是经常用于生产口服疫苗的植物材料。Arakawa等将轮状病毒肠毒素蛋白表位与霍乱毒素B亚单位(c TB)基因融合并在马铃薯中表达，然后通过口服途径免疫小鼠，结果发现小鼠能产生特异性抗血清和黏膜抗体。到目前为止，已成功用于生产转基因植物疫苗的有烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、胡萝卜、莴苣、羽扇豆、菠菜、玉米、苜蓿和藻类等。此外，疫苗还可以在植物的体外进行表达，包括利用水培植物和组培植物将外源蛋白分泌到水中和培养基中进行表达。将外源蛋白分泌到水中进行表达已经在温室栽培的烟草中得到了运用，而烟草和水稻已经建立了将外源蛋白分泌到培养基中表达的体系。

    转基因植物疫苗的表达

    转基因植物疫苗目前有稳定整合表达系统和瞬时表达系统。稳定整合表达系统中，编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体DNA序列已整合到植物细胞染色体上，可以把这种性状遗传给子代，形成表达疫苗的植物品系。目前研究成功的转基因植物疫苗多采用这种表达系统。稳定整合表达系统主要包括通过根癌农杆菌介导的核表达系统和用基因枪法把外源基因打入叶绿体中的叶绿体表达系统。叶绿体转化体系只应用于几种植物，但是叶绿体的基因拷贝数很多，利于增强目的蛋白的表达量，具有很大的潜力；叶绿体基因是严格的母系遗传，可避免植物传粉过程中的基因污染。而且不会出现基因沉默问题。

    瞬时表达系统用植物病毒作载体，外源基因不会整合到植物基因组，只在感染的细胞内进行表达，具有短时、简单、抗原产量高的优点。其缺陷是每个寄主材料都要接种病毒载体，插入外源基因的容量有限，当大于25个氨基酸时不能正确组装进入病毒衣壳蛋白，影响病毒装配和病毒的浸染能力等。

    转基因植物疫苗的作用机理

    口服疫苗到肠内黏膜诱导部位之前要经过胃内的不利环境，有效的口服疫苗必须防止被降解，否则会失去免疫原性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可使细胞中的疫苗抗原通过胃内的不利环境时受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，诱导黏膜和全身免疫反应。不仅如此，转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织(CALT)产生分泌性的Ig A(sle A)，在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应，从而大大提高其免疫有效性。已获得的转基因

    植物疫苗

    1990年，Curtiss R等报道利用转基因烟草可表达链球菌变异株spa A蛋白，口服spa A后在唾液中发现分泌免疫球蛋白Ie A(s-Ig A)。这是第一例利用植物表达系统生产口服疫苗的报道。目前已经有多种抗原在植物中得到了成功的表达，到目前为止，植物口服疫苗在人体的临床实验仅有5种。

    近年来，为了提高动物产品的质量，使人类免受人畜共患疾病的威胁，人们越来越注重畜禽动物疫苗的研究。1992年英国剑桥的Agricultrual Ge-netms Company(AGC)与美国Purdue University等合作，成功地利用豇豆花叶病毒(CPMP)在豇豆中表达口蹄疫抗原，制备了口蹄疫(FMD)疫苗。Carrilo等将FMDVVPl基因在拟南芥中得到了表达，这种抗体不仅能与VPl发生反应，而且也能与完整的口蹄疫病毒颗粒反应。最重要的是，所有免疫的小鼠都抵抗了口蹄疫病毒强毒的攻击。2006年2月，美国农业部签发批准了转基因鸡新城疫植物疫苗商品化，这是第一个被许可上市的兽用转基因植物疫苗。该疫苗是采用烟草细胞作为表达体系，生产出具有抗鸡新城疫病毒的安全有效的疫苗，这是畜禽转基因植物疫苗研究的巨大突破。除此以外，口蹄疫病毒、牛瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、禽传染性支气管炎病毒及犬细小病毒等多种动物病毒的抗原也在植物中得到了成功的表达。转基因植物疫苗现存的问题及解决方案

    转基因植物疫苗是一个新兴的研究领域，尽管利用转基因植物生产疫苗有很多优点，但就目前的技术而言，仍然有很多因素限制着植物疫苗的发展和应用。影响转基因植物疫苗的因素主要有以下几方面。

    受体植物的选择

    受体植物的选择对于转基因植物疫苗非常重要，转基因疫苗受体植物通常要具备表达量高、耐储藏和适宜口服等特点。常用于转基因植物的烟草由于不能直接食用，且含有尼古丁等一些有害人体健康的生物碱，因此不宜作为受体植物。马铃薯由于不能生吃，而烹饪又会使抗原活性丢失，因此也不是理想的受体植物。谷物类植物(如玉米)是一种较理想的疫苗表达受体，但谷物类植物由于不是农杆菌的天然宿主，难以进行遗传转化或遗传转化效率较低，要想将谷物发展为理想的植物疫苗，还有很多技术难题需要解决。从目前转基因技术来讲，番茄、苹果、香蕉和胡萝卜等蔬菜和水果是生产植物转基因疫苗比较理想的受体植物。

    转基因植物疫苗的表达效率及稳定性

    疫苗在植物中的产量取决于编码抗原蛋白的基因序列的利用率，以及构建合适的植物转化表达元件。在已报道的研究中，外源基因所表达的重组抗原蛋白大约只占植物可溶蛋白的0.01%~0.37%，要达到提高外源蛋白表达量可从优化启动子和外源蛋白的表达部位入手。此外，也可将外源基因导入植物叶绿体基因中，以提高外源蛋白的含量。近年来，也有越来越多的科学家使用植物病毒作为瞬时表达载体来生产疫苗，使外源基因随着病毒复制而在植物体内增殖，瞬时高效表达外源蛋白。

    转基因植物疫苗的生物安全性

    用于筛选转基因植株的抗生素基因，可能对环境安全和人体健康产生潜在的危害。释放到环境中的转基因植物，对环境中的许多有益生物也将产生直接或间接的不利影响。此外，转基因植物还可能将一些抗病或对环境胁迫具有耐性的基因转移给杂草，严重威胁其他作物的正常生长和生存。另外，人或动物口服转基因植物后还可能对机体产生某些毒理作用或引起过敏反应，这些不良作用在进行临床实验前必须进行充分的验证，确保植物疫苗的安全性。

    转基因植物疫苗的耐受性

    机体对口服疫苗的免疫耐受性与免疫系统的抑制性T淋巴细胞(Ts)的功能密切相关。免疫耐受的程度与免疫剂量、免疫程序、抗原特异性等多种因素有关。减少疫苗服用次数，加大每次摄入量等方法可以减少免疫耐受的发生。因此，有必要对转基因植物疫苗进行免疫耐受方面的实验，找到避免口服免疫耐受的最佳免疫方案。

    用转基因植物生产疫苗，与传统的微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，具有许多潜在的优势。尽管生产转基因植物疫苗还有许多问题需要解决，但这丝毫不影响转基因植物疫苗的开发利用。随着科学技术的不断发展，外源基因在转基因植物中的表达效率和转基因产物的免疫性将进一步提高。相信在不久的将来，转基因植物疫苗必将成为预防疾病的重要途径，许多病毒和细菌抗原，都可能制成转基因植物疫苗，使转基因植物疫苗真正运用到医学实践和畜牧业生产中。