饲料中维生素B1测定方法

    本标准规定了饲料中维生素B1的测定方法。

    本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B1的测定。萃取液的浓度范围为0.02～0.2μg/mL（在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质的情况下，本标准不适用）。

    2 引用标准

    GB 6682 实验室用水规格

    3 方法原理

    试样中的维生素B1（即硫胺素C12H17ON4SCl）经稀酸消化、酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁氰化钾氧化生成荧光色素——硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B1的含量成正比，依此进行定量测定。

    4 试剂和溶液

    除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。

    4.1 盐酸溶液，0.1mol/L：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。

    4.2 硫酸溶液，0.05mol/L：将2.8mL浓硫酸（GB 625）加入水中，稀释至1000mL。

    4.3 乙酸钠溶液，2.0mol/L：取164g无水乙酸钠（GB 694）或272g结晶乙酸钠（CH2COONa·3H2O GB 693）溶于水，稀释至1000mL。

    4.4 淀粉酶悬浮液，100g/L：用2.0mol/L乙酸钠溶液（4.3）悬浮10g淀粉酶制剂（Takadiastase，或相当活性的其他磷酸酯酶），稀释至100mL，使用当日制备。

    4.5 氯化钾（GB 646）溶液，250g/L。

    4.6 酸性氯化钾溶液：将8.5mL浓盐酸加入至氯化钾溶液（4.5）中，惭稀释至1000mL。

    4.7 氢氧化钠（GB 629）溶液，150g/L。

    4.8 铁氰化钾（GB 644）溶液，10g/L。

    4.9 碱性铁氰化钾溶液：4.0mL的铁氰化钾溶液（4.8）与氢氧化钠溶液（4.7）混合使之成100mL，此液4h内使用。

    4.10 冰乙酸（GB 676）溶液，30mL/L。

    4.11 人造沸石（Q/HG 12-445-63，60～80目）使用前必需活化，方法如下：

    将适量人造沸石置于大烧杯中，加入10倍容积的热乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均匀搅动10min，使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液。重复上述操作两次。换用5倍其容积的热氯化钾溶液（4.5）搅动清洗两次，每次15min。再用热乙酸溶液洗10min。最后用热蒸馏水清洗沸石至无氯离子（用10g/L硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，100℃烘干，贮于磨口瓶中备用。使用前，检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率，如达不到92%，需重新活化沸石。

    4.12 硫胺素标准溶液

    4.12.1 硫胺素贮备液Ⅰ：盐酸硫胺素纯品（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器24h，称取0.0500g，溶解于ph4.5～4.3的20%（V/V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低温保存。该溶液每毫升含0.1mg硫胺素。

    4.12.2 硫胺素贮备液Ⅱ：取硫胺素贮备液Ⅰ（4.12.1）10mL用酸性20%乙醇溶液定容至100mL，盛于棕色瓶中低温保存。该溶液每毫升中含10μg硫胺素。

    4.12.3 硫胺素标准工作液：取贮备液Ⅱ（4.12.2）2mL与65mL盐酸溶液（4.1）和5mL乙酸钠溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。现用现配。该溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。

    4.13 硫酸奎宁（Q/HG 22-797-68）溶液

    4.13.1 硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.1000g，用0.05mol/L硫酸（4.2）溶解并定容至1000mL，贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制。该溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎宁。

    4.13.2 硫酸奎宁工作液：取贮备液（4.13.1）3mL，用0.05mol/L硫酸定容至 1000mL，盛于棕色瓶中，低温保存。该溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎宁。

    4.14 正丁醇（HG 3-1012），其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4%，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取114℃～118℃馏份。

    4.15 无水硫酸钠（HG 3-123）。

    5 仪器、设备

    5.1 荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。

    5.2 电热恒温水浴。

    5.3 电热恒温箱。

    5.4 实验室用样品粉碎机。

    5.5 分析天平：感量0.0001g。

    5.6 注射器：10mL。

    5.7 吸附分离柱：全长235mm，外径×长度如下：

    上端贮液槽容量约为50mL，35mm×70mm；中部吸附管8mm×130mm；下端35mm；下端35mm拉成毛细管。

    5.8 反应瓶：具塞离心管25mL。

    6 试样的制备

    选取有代表性的饲料样品，至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。

    7 分析步骤

    7.1 称样：称取单一饲料、配合饲料或浓缩饲料1～2g（约含硫胺素4～20μg），精确至0.001g。维生素预混料0.25～0.5g，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中。

    7.2 提取

    7.2.1 水解：将0.1mol/L盐酸（4.1）65mL加入试样瓶（7.1）中，经沸水浴加热30min，开始加热5～10min内不时摇动容量瓶，以防结块。或于121℃～123℃15磅高压釜中加热30min。

    7.2.2 酶解：冷却容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶悬浮液（4.4），摇匀。该试液的pH约为4.0～4.5，将容量瓶于45℃～50℃恒温箱中保温3h，取出冷却调整pH4.5，用水稀释至100mL。

    7.2.3 过滤：将试液通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5mL，收集滤液于锥形瓶中。预混料提取液需逐级稀释，使之含硫胺素约为0.2μg/mL。

    7.3 提纯

    7.3.1 制备吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小烧杯中，加入3%乙酸溶液（4.10）浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脱水），过柱流速≤1mL/min为宜。再用10mL近沸的洗柱一次。

    7.3.2 吸25mL提取液（7.2.3），慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，弃去洗液。

    7.3.3 用25mL 60℃～70℃酸性氯化钾（4.6）分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾定容，混匀。

    7.3.4 同时用25mL硫胺素标准工作液（4.12.3）。重复7.3.1～7.3.3操作，作为外标。

    7.4 氧化与萃取（以下操作避免紫外光照射）

    7.4.1 于两只反应管中各吸入5mL洗脱液（7.3.3），记作A、B。

    7.4.2 向B管加3mL氢氧化钠溶液（4.7），再向A管中加3mL氧化剂碱性铁氰化钾溶液（4.9），轻轻旋摇。依次立即向A管加15mL正丁醇加塞，剧烈地振摇15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共同振摇90s，静置分层。

    7.4.3 用注射器吸去下层水相，向各反应管加入约2g无水硫酸钠（4.15），旋摇，待测。

    7.4.4 同时将5mL作为外标的洗脱液（7.3.4），置入另两只反应管，相应地记作C、D，按7.4.1～7.4.3操作。

    7.5 测定

    7.5.1 用硫酸奎宁工作液（4.13.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。

    7.5.2 于激发波长365nm，发射波长435nm处测定各反应管中萃取液［（7.4.3）和（7.4.4）］的荧光强度。

    8 分析结果的计算和表述

    8.1 计算公式

    硫胺素（维生素B1）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式计算：

    硫胺素（VB1mg/kg）＝〔（T－T0）/（S－S0）〕×C×（V2/V1）×（V0/m）

    式中：T──A管试液的荧光强度；T0──B管试液空白的荧光强度；S──C管标准溶液的荧光强度；S0──D管标准溶液空白的荧光强度；C──硫胺素标准工作液浓度，μg/mL；0──提取液总体积，mL；V1──分取提取液过柱的体积，mL；V2──酸性氯化钾洗脱液体积，mL；m──试样质量，g。

    8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。

    9 重复性

    同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值；在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg时，不得超过平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg时，不得超过平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg时不得超过平均值的5%。