美国转Bt基因抗虫玉米研究进展

     欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis（Hbn.）是北美严重影响玉米产量和品质最重要的害虫，转Ｂｔ基因抗虫玉米（以下简称Ｂｔ玉米）的商品化，为控制玉米螟为害提供了新的途径。

    一、Ｂt玉米的培育

    植物遗传研究人员将选定的外源DNA插入玉米植株的DNA。为了保持产量、丰产性和抗病性等重要的农艺性状，种子公司选择优良的杂交种用来作Ｂｔ玉米的转育。

    导入玉米的基因载体由３种基本成分组成：（１）蛋白质基因。即为更好的在玉米体内表达，产生晶体蛋白的经过修饰的Ｂｔ基因，目前在美国和加拿大应用的第一代Ｂｔ玉米杂交种所表达的是Cryl Ab、Cryl Ac或Cry9C中的一种基因。在不久的将来，转基因杂交种可能会产生其他晶体蛋白或其他来源的蛋白。（２）启动子。是用来控制晶体蛋白在植株体内表达部位和表达量的，有些启动子限定晶体蛋白在植株的特定部位如光合作用的绿色组织和花粉中表达，如ＰＥＰＣ，而有些启动子可以在全株表达晶体蛋白，如CaMV/35S。（３）标记基因。标记基因的存在可以使种子公司鉴定是否已将外源基因成功导入。常用的标记基因包括抗除草剂基因如Round Up和Liberty R以及抗体基因。

    通过不同的植物转化技术将基因载体插入到玉米中并成功的转化，称为转化子，转化子将基因载体和Bt DNA切入到玉米ＤＮＡ的部位不同。切入点的不同可影响Ｂｔ蛋白的表达并可能影响植株的其他功能。因此，种子公司很认真地审查转化子，以确保Ｂｔ蛋白的产生对农艺性状没有副作用。

    Bt玉米于1995年经美国环境保护局（EPA）批准登记后，到1997年９月美国环境保护局（EPA）已登记了４种用于商业的不同转化子，它们是：Novartis种子公司和Mycogen种子公司的176，Northrup King／Novartis种子公司的BT11，孟山都（Monsanto）公司的MON810和DEKALB公司的DBT418。176分别被Novartis和Mycogen注册商标为“Knock Out”和“Nature Gard”，而BT11和MON810的商标均为“Yield Gard”，DBT418的商标为“Bt-Xtra”，最近，Agr Evo公司将CBH351转化子注册为“Stralink”。176、BT11和MON810转化子表达的蛋白均为Cryl Ab，DBT418表达的蛋白为Cryl Ac，而CBH351所表达的为Cry9c。了解这些转化子和它们如何影响表达对选择玉米杂交种是至关重要的。

    二、Ｂｔ玉米的杀虫效果及对天敌的影响

    １ 对欧洲玉米螟的控制作用同现行的综合防治技术相比，Ｂt玉米有明显改进对欧洲玉米螟控制的潜力，化学杀虫剂在施用适时的情况下，对第一代和第二代玉米螟幼虫的防效分别是60%～95%和40%～80%。任何一种Bt玉米对心叶期一代玉米螟的控制效果均在99%以上，而对二代玉米螟幼虫的控制效果则因品种而异。这同Ｂｔ玉米品种之间的Ｂｔ基因种类以及在玉米植株体内表达的部位有关，如在大量人工接种条件下， BT11和MON810和176对心叶期一代玉米暝的防效都高达96%左右，虽然这３个品种表达的Ｂt基因均为Cryl Ab，但对穗期二代螟的防效却明显不同，176的防效仅有75%，其原因是BT11和MON810全株都能产生晶体蛋白，而176仅在植株的绿色组织和花粉中产生毒蛋白，部分取食花丝和子粒的幼虫后期钻蛀茎秆和穗轴。而在不同Ｂt玉米植株不同发育阶段人工接种４龄的欧洲玉米螟幼虫， BT11和MON810和CBH351可以有效控制玉米螟为害，176在营养生长阶段可以有效控制大龄玉米螟幼虫，但在抽雄进入生殖生长阶段后，其蛀孔隧道数增加，而DBT418在营养生长和生殖生长阶段对大龄幼虫的控制效果均不理想。另有田间试验表明，取食Bt玉米CBH351叶片的２～４龄欧洲玉米螟在４ｄ内全部死亡，即使在过量的人工接种下，平均每株蛀孔隧道长度仅为0.09～0.14cm，而对照则分别为30和23cm。

    ２ Ｂt玉米对玉米其他害虫及病害的控制作用根据在衣阿华州和堪萨斯州实验室和田间试验结果表明，目前应用的Ｂt玉米对蚜虫、玉米叶螨、地老虎，以及地下害虫玉米切根叶甲、金针虫、蛴螬、瓜种蝇和玉米小蝼甲等害虫无效。肯塔基大学的研究表明，对玉米的其他害虫控制效果因Ｂt玉米转化子的不同而异，表达Cryl Ab和Cryl Ac基因的Ｂt玉米对地老虎无效，但初步的田间试验表明，表达Cry9c基因的CBH351Ｂｔ玉米对地老虎有很好的控制作用。BT11和MON810可以使玉米穗虫为害降低50%～70%，对秋黏虫的防效可达50%～70%，而176却效果很差，同时表达BT11和MON810的子粒对印度谷螟有很好的控制作用，176则无效。不同Ｂｔ玉米对西南玉米螟的控制效果明显不同。

    由于Ｂｔ玉米降低了病原菌可以侵入的孔道，因此，可以降低玉米茎、穗粒腐病的发生，连续３年的研究表明，在人工接种玉米螟后，与非ＢT对照玉米相比，在表达Cryl Ab的ＢT玉米上由镰刀菌引起的玉米穗腐发病率、严重程度和粒腐率，分别下降了58%～68%、54%～96%和17%～38%，同时，还减轻了黄曲霉毒素对玉米子粒的污染。

    ３ ＢT玉米对有益昆虫和害虫天敌的影响大量研究结果表明，ＢT晶体蛋白对杀死鳞翅目幼虫有极高的选择性。ＢT玉米对有益昆虫包括蜜蜂、瓢虫、草蛉幼虫、蜘蛛、猎蝽和寄生蜂没有不良影响，如对取食含有Ｂt毒蛋白花粉的捕食性天敌十二星瓢虫和小暗色花蝽的生长和捕食能力无明显影响，Ｂt玉米上欧洲玉米螟卵以及幼虫的被捕食率和寄生率以及捕食性天敌的数量同非Ｂt玉米上的差异并不显著。在实验室用取食Ｂt和非Ｂt玉米的欧洲玉米螟饲养普通草蛉幼虫，在死亡率上没有明显差异，但取食前者的草蛉幼虫发育时间较后者延长，表明Ｂt降低了草蛉幼虫的适合度，可能是Ｂt与病态猎物引起的营养不足共同影响所致。尽管如此，Ｂt玉米对欧洲玉米螟天敌的间接影响是存在的，捕食性、寄生性天敌及病原菌的数量可能随玉米螟种群数量的下降而降低。

    三、欧洲玉米螟对Ｂt玉米的抗性预测及其治理

    １ 产生抗性的可能性已知昆虫有对某些农药较快地产生抗性的能力，抗性产生的部分原因是农药的高浓度条件下的频繁施用。目前已有500多种昆虫和螨类对杀虫剂和杀螨剂产生了抗性，因此，欧洲玉米螟有对Ｂt晶体蛋白产生抗性的潜在能力。目前，已有15种不同昆虫的实验室群体对Ｂt蛋白产生了抗性，这些昆虫包括印度谷螟、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、红铃虫以及马铃薯甲虫。而在美国的夏威夷和佛罗里达州的小菜蛾田间种群已对Ｂt杀虫剂产生了很高的抗性。

    影响抗性发展的因素有很多，对欧洲玉米螟来说，这些因素包括：Ｂt玉米种植的面积、玉米螟在生长季节的较高死亡率以及每年发生两代或更多世代。在明尼苏达、堪萨斯和特拉华州的实验室研究已确信，欧洲玉米螟能够对Ｂt杀虫剂或Ｂt晶体蛋白产生中等程度的抗性，杀死这些抗性品系50%的种群所需毒蛋白比敏感品系要高出30～60多倍，这些中等抗性水平的欧洲玉米螟是在相对小的实验室种群在用Ｂt蛋白处理7～9代后产生的。将玉米螟连续饲养在加入不同浓度纯化的Cryl Ab蛋白的人工饲料上，结果表明，玉米螟对人工饲料中低浓度的Cryl Ab可以产生一定程度的耐性，但在接近Ｂt玉米实际表达量的Cryl Ab的浓度的人工饲料上取食的玉米螟群体却不能保存下来，而且在经过13代的汰选后的不同玉米螟群体，接种到温室中表达Cryl Ab的Ｂt玉米上后都不能存活。虽然这些研究结果确认欧洲玉米螟有对Ｂt产生抗性的遗传潜力，但实验室研究并不能证明在田间条件下可以产生抗性。在田间条件下Ｂt玉米和欧洲玉米螟处在一个完全不同于欧洲玉米螟在实验室取食Ｂt杀虫剂的环境。尽管如此，欧洲玉米螟对Ｂt玉米产生抗性的威胁确实存在。

    ２ 对Ｂt玉米产生抗性的预防及治理面对欧洲玉米螟有可能对Ｂｔ玉米产生抗性的潜在威胁，有必要制定避免或延缓抗性风险产生的治理规划。抗性治理是害虫综合治理实践的一个关键因子，美国环保署对Ｂt玉米商品化签署的是有条件的注册，需要销售Ｂt玉米种子的公司在2001年制定并实施抗性治理规划。

    目前Ｂｔ玉米抗性治理是基于两个互补原则，高剂量和避难所。植物遗传工作者设计的Ｂｔ玉米能产生非常高水平的Ｂt晶体蛋白，远高于防治玉米螟Ｂｔ杀虫剂的用量，目的是杀死所有没有抗性基因（ｒｒ）和有１个抗性基因（ｒｓ）的欧洲玉米螟幼虫，这种假设是基于Ｂｔ玉米杂交种已达到这种高剂量的目标。如果高剂量的目标不能达到，带有１个抗性基因的玉米螟幼虫可以存活至成虫，并与带有其他抗性基因的成虫交尾，大多数这种组合的后代有可能对Ｂｔ玉米产生抗性，经逐代积累，抗性频率不断加大，而Ｂｔ玉米由于不断表达毒蛋白，为抗性产生提供了理想的环境条件。

    抗性治理规划的第二个原则是应用避难所，是目前唯一有效的抗性治理措施，避难所的目的是为欧洲玉米螟提供非Ｂｔ玉米或Ｂｔ农药环境，可以与来自附近Ｂｔ玉米的潜在抗性玉米螟交尾。避难所的目标是为每一个抗性成虫提供过量的敏感成虫。避难所可以是任一欧洲玉米螟的非Ｂｔ寄主，包括非Ｂｔ玉米、马铃薯、甜玉米、棉花或田间杂草寄主。在避难所内也不能应用Ｂｔ生物农药颗粒剂或进行叶面喷雾，只有在欧洲玉米螟暴发时，利用杀虫剂防治避难所内的非Ｂｔ玉米，以使经济损失减低到最低程度，同时仍可提供足够量的敏感玉米螟。至于避难所的面积，根据欧洲玉米螟生物学、抗药性方面的知识和计算机模拟模型估计，避难所的面积应接近20-30%。同时，Ｂｔ和非Ｂｔ玉米的田间布局也是非常重要的，避难所的玉米螟必须与抗性玉米螟同时羽化，而且在能够与抗性玉米螟交尾的范围内。因此，每一农场应该在毗邻Ｂｔ玉米田设有一个或多个避难所。

    避难所的实际数量因地区、农场以及玉米生产体系而异，但将暴露在Ｂｔ蛋白上的幼虫种群控制在20-30%的目标是一致的。在玉米连作混合大豆与玉米轮作区，主要的避难所为非Ｂｔ玉米，因此玉米播种面积的20-30%应为非Ｂｔ玉米。在应用杀虫剂防治玉米螟的玉米连作区，避难所的面积应提高到40%以补偿幼虫死亡率。在玉米播种面积小，且与欧洲玉米螟种群相关的转换寄主不包含Ｂｔ蛋白的地区，较小规模的避难所是可行的，这种避难所规模的降低是基于来源于转换寄主和玉米上的玉米螟同期羽化的假设。当来源于当地非Ｂｔ寄主的玉米螟种群的比例不详的，种植20-30%的非Ｂｔ玉米避难所是延缓抗性最简单和最保险的措施。