我国兽用生物制品技术的发展历程与展望(1)

    兽用生物制品可以分为以下四类；1、疾病预防用生物制品，包括细菌、病毒、寄生虫疫苗和类毒素等；2、疾病治疗用生物制品，包括高免血清、高免蛋黄抗体、抗毒素及干扰素等；3、诊断检测用生物制品，包括抗原、抗体等；4、免疫调节类生物制品，包括免疫凋节剂和微生态制剂等。作为畜禽疾病预防控制的有力武器，兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥着越来越重要的作用，畜牧业的发展带动了兽用生物制品的技术进步，后者的进步反过来又促进了畜牧业的繁荣。二十世纪，特别是中华人民共和国成立后的五十多年内，随着科学技术的飞速发展，兽用生物制品发生了翻天覆地的变化，新技术、新方法的出现和广泛推广应用，为我国兽用生物制品的技术进步提供了原动力。

    一、我国兽用生物制品技术发展的历程回顾

    我国兽用生物制品研究和生产，始于19l8年的青岛商品检验局血清所和19l9年的北平中央防疫处，继于1932年前农业部建立了上海血清制造所，1936年再建中央农业实验所畜牧兽医系，先后20年中生产的兽用生物制品有：抗牛瘟血清、抗猪瘟血清、猪肺疫、牛出败、禽霍乱抗血清等；牛瘟脏器苗、炭疽芽孢苗、狂犬病疫苗、牛肺疫疫苗、猪肺疫疫苗以及马鼻疽菌素、牛结核菌素、炭疽沉降素等。在这个时期内的产量不大，没有统一的产品质量标准，而且主要以发病动物脏器为抗原制成灭活疫苗，生产技术也较原始。

    1938年后进入抗日战争和解放战争年代，使得正在兴起的生物制品业受到了影响，发展缓慢。但由于畜禽疫病流行较为严重。仅以牛瘟流行情况为例，每三、五年就大流行一次，以1938~1941年年间的初步统计记载，在川、康、青、藏、甘等部分地区死牛100万头以上；鸡的死亡更多，病死率高达60%以上。因而即是在抗日战争紧张年代，兽医生物制品的研究与生产也没有停止。如原中央农业实验所兽医系迁至四川荣昌恢复生产，解放军兽医部门在贵州扎佐成立军马防治所，生产军马所需生物制品。1941年成立农林部中央畜牧实验所，设立荣昌血清厂，生产的品种有牛瘟脏器苗、猪瘟疫苗、抗猪瘟血清、抗出败血清、抗猪丹毒血清、鸡新城疫疫苗及猪出败疫苗。

    1945年抗日战争结束前后，为了控制畜禽疾病流行，相继成立了西南、东南、华北、华西、西北五个兽疫防治处，负责生产各辖区内及陕、甘、宁、青、内蒙古和绥远等区的兽医防治所需生物制品。虽然在一定范围内扩大了产品种类和生产量，引进了一些外国技术，但因设备简陋，物资缺乏，又没有统一的质量标准，从事研究与生产的技术人员缺少，仍然停留在较低技术水平上，防疫效果不显著。其后撤处并厂，建立了较完整的七个兽医生物药品厂。

    1949年新中国建立后，党和政府十分重视兽医防制工作，积极培训技术人员，加强生产技术的交流，并展新产品研究，改进生产工艺，在1952年邀请前苏联专家帮助，通过调查研究，举办生物制品人员讲习班，在我国已有产品水平上，制订出了我国第一部《兽医生物药品制造与检验规程》和生物药品监察制度。制订出36个产品的生产与检验规程，初步统一了我国生物制品的质量标准，虽仍是一般传统方法，但终究有章可依，不经检验合格的产品不得出厂，保证了产品使用的安全。生产的生物制品产量达到1.2亿毫升，较建国前两年增加了3倍以上。进入50年代，除进一步充实、调整、改善了原有的兰州、江西、广西、南京、开封、成都、哈尔滨七个兽医生物药品厂外，在大跃进摧动下，又筹建了新疆、西藏、内蒙及各省市、区新的兽医生物药品制造厂，总数达28个。在此期间，我国组成生物制品专家赴前苏联和民主德国考察兽医生物药品制造技术。学习先进经验，首次按国际标准，制订了我国的鼻疽菌素、结核菌素和布氏杆菌病诊断抗原检验标准，同时各制药厂和一些兽医研究单位，也逐步提高了研制技术，并创造性的用牛瘟兔化弱毒就地制苗，用此疫苗开展普遍预防接种，于1956年在全国消灭了牛瘟。继而研制成功的猪瘟兔化弱毒疫苗，在制药厂成批生产乳兔组织苗和试生产冷冻干燥疫苗，大力推广使用春秋两季全面注射免疫，控制了猪瘟的流行。口蹄疫的乳兔苗也开始大批量生产，这些以通过异种不敏感动物传代减毒，使致弱毒株保持了良好免疫原性，再用乳兔组织制苗并推广应用，较快控制与消灭疫病的方法，在当时是处在国际领先技术水平的。

    在通过异种不敏感动物获得免疫原性良好制苗菌（毒）株的同时，微生物诱变技术，从多方面开展了研究，并选育成功一批良好的制苗用弱毒株。如用加锥黄素培养基培养，结合动物诱变方法选育出了猪丹毒GC42和G4TI0弱毒株；用加化学药剂，如醋酸铊等或以逐步提高培养温度方法，选育成功了仔猪副伤寒C500弱毒菌株和羊，猪链球菌弱毒株；以鸡痘毒通过鹌鹑制弱毒苗，将猪肺类支原体强毒株经乳兔交替传代减毒，培育成猪喘气病弱毒组织苗。口蹄疫O型乳兔组织苗及口蹄疫A型鸡胚化弱毒苗；以及多株禽霍乱弱毒株，猪肺疫E0630弱毒株等。在大量活疫苗研制成功的同时，冷冻真空干燥技术和设备也得到改造。60年代末，在大瓶通气培养生产菌苗的基础上，用大发酵罐培养，进一步提高了工艺，细菌产品的质量和数量成倍增长，基本上满足了防疫的需要。20世纪70年代开始，进一步调整了兽医生物制品生产结构，诊断制品主要由成都和吉林制药厂生产供应，抗血清主要由成都与兰州厂生产，至1972年产品种类达到85种，产量38亿余毫升。另外，还有一批试制产品12种。一些新技术相继用于多种菌疫苗的研究与生产，如用通气培养生产炭疽芽孢苗，研究成功了马传染性贫血诊断抗原。用驴白细胞减毒制成马传染性贫血弱毒活疫苗，又一次在同类产品中领先国际水平。由此，以制苗为目的微生物诱变技术，由动物水平提高到了细胞水平，并用细胞培养技术，选育成功了鸭瘟、羊痘等制苗弱毒株。生产工艺采用鸡胚成纤维细胞，猪肾、牛睾丸原代细胞生产猪瘟弱毒苗、鸡新城疫弱毒苗以及牛环形泰勒虫白细胞疫苗等。结合这一时期冻干技术和冻干产品的稳定剂成功应用，生产出了多种质量良好的冻干疫苗。猪丹毒、猪肺疫二联苗、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗等多联疫苗的投入生产使用，一针防多病，推进了全面防疫工作。同时灭活疫苗的佐剂由初期使用明胶，改进用氢氧化铝胶，进而成功使用油乳剂为佐剂，提高了生物制品免疫力和延长了免疫期，把生产技术提高到一个新的阶段。

    在诊断方法和试剂方面，逐步完善了传统的血清学诊断方法和诊断试剂，如凝集反应试验、沉淀反应试验、补体结合试验和中和试验，它们作为抗原或抗体的检测手段，主要应用于传染病的诊断和血清定型等方面。70年代后期，由于免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验等方法的出现，把反应的敏感性又提高了一大步。

    根据以上所述的简况，我们认为我国生物制品的研究与生产，从50年代以通过异种动物或加化学药剂培养方法，选育出了多种制苗弱毒株，但生产工艺基本上末脱离手工操作，并以生产灭活苗为主，后期则活疫苗和诊断制品大量增加。70年代后期，开展了细胞培养技术，改进大发酵罐培养技术，无论是产品种类和数量都有很大提高。1985年统计，经批准生产的生物制品品种达124种，其中达到国际水平的约占21%，活疫苗占疫苗总数的62%，诊断制品占30%。

    二、目前我国兽用生物制品技术的研究进展和推广应用状况，在世界上所处的水平、存在的问题及与发达国家的差距

    （一）研究进展和应用推广

    近二十年来，由于畜牧业的飞速发展，对兽用生物制品无论是从品种数量，还是从质量上都提出了新的要求。随着现代生物技术的进步和推广应用，生产企业管理水平的提高以及国际间信息交流的增多，特别是国家的重视和投入增加，我国的兽用生物制品事业发生前所未有的变化，具体表现在以下几个方面：

    1．生物技术在诊断试剂和诊断方法的应用方面：主要包括单克隆抗体，核酸探针和聚合酶链反应（PCR）等技术的建立和应用。

    （1）单克隆抗体。

    在疾病诊断、病原分类与鉴别、血清分型、疫苗毒株与野毒株的区分上，单克隆抗体发挥着巨大的作用。这些年国内已研究出大量的单克隆抗体，据不完全统计，我国已有二十多个单位分别建立了针对哺乳动物的12种病毒、禽类的9种病毒、各种动物的12种病原细菌、10种寄生虫及一些微生物毒素和其他可能用于疫病诊断的数百个杂交瘤细胞株，单抗的种类己覆盖了大多数传染病。

    在这些单抗中，一些已在推广应用之中，这些包括：抗马传染性贫血病毒的单抗，可用于免疫马和自然发病马的鉴别诊断、鉴别强弱毒的鸡新城疫病毒单抗和猪瘟单抗、用于疫苗鉴别的马立克氏病病毒单抗、传染性囊病病毒单抗等。

    （2）核酸探针：该技术是80年代初期发展起来的一种基因诊断技术，与传统病原分离和血清学方法相比，它具有简便、快速、高度特异的优点。特别是一些难于分离培养的病原微生物如结核分枝杆菌、支原体、立克次氏体、密螺旋体等，使用核酸探针，通过原位杂交等认定组织中是否存在病原微生物的特殊区域段基因，就可以确定被检测动物是否被感染。

    （3）PCR：多聚酶链反应（PCR）技术是诞生于80年代的一项体外酶促扩增DNA新技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、节省时间等优点，现已用生物学科的各个领域，它可以将被检样品中单考贝基因序列扩增到毫克水平。各种临床样品，如血液、组织细胞、粘液、固定保存的病理样本都可用PCR进行检测。PCR以及更为敏感的套式PCR，检测多个目的基因的复合PCR技术结合核酸探针、基因序列分析等技术，在疫病的诊断中发挥着巨大作用。该方法已在国内逐步推广使用。

    2．基因工程疫苗

    由于自然变异和新病原的不断出现，常规疫苗在安全和效力方面的局限性愈来愈明显，特别是一些难以人工培养，免疫原性差或毒力偏强的微生物或疫苗，利用生物技术手段开发新型疫苗以取代现用的常规疫苗是必然趋势。由中国军事医学科学院等单位将猪致病性大肠杆菌的k88、k99柔毛质粒导入非致病性大肠杆菌，成功地制备成双价大肠杆菌疫苗。该疫苗已广泛应用于全国各地，有效地预防了猪大肠杆菌病的流行，取得了明显的经济效益。此外，扬州大学农学院构建了马立克氏病毒的基因的重组禽痘病毒，哈尔滨兽医研究所已构建了表达传染性法氏囊病毒VP2基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组禽痘病毒。试验证明，重组病毒能诱导SPF鸡产生免疫保护作用。同时还成功地将马立克氏病病毒gB基因插入到火鸡疱疹病毒中，构建表达了马立克氏病病毒gB基因的重组火鸡疱疹病毒。这种重组疫苗免疫接种SPF鸡的免疫保护率高于单一的火鸡疱疹病毒疫苗和Ⅰ系马立克氏病疫苗。哈尔滨兽医研究所利用杆状病毒表达的禽流感病毒、Hs亚型血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因的亚单位疫苗及以脂质体传染技术构建的H7亚型禽流感病毒、血凝性基因重组的鸡痘病毒，均能使鸡产生良好的免疫保护作用。H5和H7亚型HA基因重组禽痘病毒载体疫苗也即将获得成功。据悉，上海大学复旦大学合成的口蹄疫多肽疫苗已进入中试生产阶段。

    3．在常规兽用生物制品方面，无论是量还是质上都有明显的进步据1997年的统计资料：仅作为兽用生物制品主要来源的我国28家生物药品厂，生产的畜禽及人畜共患病疫苗共为七大类44个品种，总量为403亿头（羽）份；诊断液6个品种15万毫升。大专院校和科研单位的中试车间的年产量估计达150亿头（羽）份。另外一块是进口疫苗，大概为50亿羽（头）份。在所有疫苗中，禽用疫苗占95%以上。而在1990年，全国的兽用疫苗总产量才为77亿头（羽）份，发展速度之快令人难以想象。但诊断液当时为34个生产品种，163万毫升，明显高于1997年，这是因为诊断液需求量不稳定、成本高、经济效益不大，厂家不愿意生产所致。

    在技术进步方面，主要表现在疫苗品种的明显增加，使一些新的疾病能得到及时控制，另外，这些年在活疫苗的冷冻真空干燥工艺、灭活疫苗的生产乳化工艺方面及疫苗的质量控制系统的完善方面，都有明显的进步。

    （二）存在的主要问题和与国外的差距

    目前，就我国兽用生物制品在国际上所处的位置而言，在疫苗品种方面，有部分产品我国居国际领先水平，如猪瘟活疫苗、马传染性贫血活疫苗、布氏杆菌猪二号活疫苗和猪喘气病活疫苗等，而更多的是达到或接近国际水平，部分产品水平低下；在诊断液方面，大部分产品达到国际水平，但由于经济效益的问题，现在突出的是品种不配套，研究出的成果没有充分利用；就产品特别是活病毒疫苗产品的质量标准而言，我国与国外还存在一些差距，具体表现在外源病原的检测上。尽管我国已制定出部分外源病原污染检测方法并积极推广，但尚未得到有效的贯彻执行，而发达国家的法规则明确要求，对活病毒疫苗作外源病原污染检测，以保证疫苗的纯净性；而在基因工程技术和产品方面，我们则存在明显的差距。就总的技术状况而言，我们还处在发展阶段，以全国28个兽用生物药厂的情况看，存在的主要问题表现在以下几个方面：

    1．就冻干活疫苗而言，我们目前在技术上存在的主要问题是冻干保护剂的问题还没有完全解决。我们目前使用的牛奶蔗糖或明胶蔗糖对解决在冷冻真空干燥过程中保持抗原的存活性和良好物理性状等方面的问题是可行的，价格低廉，工艺也成熟，但用这种冻干保护剂制成的冻干产品只能在-15℃以下的条件保存才能达到l年以上的保存期，这给疫苗的运输及保存带来很多困难，也增加了疫苗因保存条件不当失效而导致免疫失效的问题，特别是在农村基层兽医单位及经济不发达地区。而在国外，特别是一些发达国家，已普遍使用耐热冻干保护剂，使疫苗在4~10℃的条件下保存期活性稳定在2年以上，这就不但解决了疫苗在冻干过程中的活性问题，而且有效的解决了疫苗在保存期间因温度升高而使疫苗失活的问题，既降低了保存条件，减少了费用，又避免了因疫苗保存失效而导致的免疫失败问题。

    2．在灭活疫苗方面，经过中国兽药监察所的大量研究工作，为灭活苗大面积推广应用创造了一个良好的前提，它较好的解决了疫苗的保存问题及在体内的缓释问题，大大提高了疫苗的免疫效力和免疫持续时间。但随着研究工作的进一步深入，我们发现我国目前普遍使用型号的矿物油存在着明显的安全问题。因为这种工业用液体石蜡油里所含与致癌有关的稠环芳烃明显高于医用石蜡油。另外，试验表明该疫苗对大日龄成年鸡注射后有时会引起严重的副反应，对猪等大动物也不安全。另外，我国的油佐剂灭活苗的制造工艺也不过关，有的在短期内就破乳分层，有的稠度太大给注射带来麻烦，特别是在抗原浓缩方面的技术还没有很好的解决，给多联苗的大批量生产带来困难，导致用量太大而出现不安全。

    3．在制苗用原材料使用标准的控制方面，我们还存在着很大的问题，其中最主要的问题是禽用活病毒制苗用鸡胚的标准上。这些年来，我国禽用疫苗已占到所有疫苗产量的95%以上，然而，在多数兽用生物药厂还普遍使用普通鸡胚制苗，用这种普通鸡胚制造疫苗存在两大问题：一是外源病原的污染问题，这种污染既有细菌、支原体，也有病毒，细菌主要是沙门氏菌。这种细菌可以经感染鸡垂直传播给鸡蛋，用这种鸡蛋制造疫苗势必造成疫苗的污染；支原体污染是非常严重的问题，调查表明：我国鸡群中50~80%的鸡都为支原体感染阳性，这种病原体同样可以经蛋垂直传播。90年对全国各厂家生产的100多批疫苗的支原体分离结果显示，用普通鸡胚或鸡胚成纤维细胞制造的疫苗，60%以上都污染了支原体。还有一些病毒如鸡传染性支气管炎病毒、鸡淋巴白血病病毒、传染性贫血因子、网状内皮增生症病毒、呼肠弧病毒、鸡传染性法氏囊病病毒等都可经污染胚造成疫苗的污染。由此可见，用普通胚制苗可造成疫苗中外源病原的污染，并由此而传染疾病。二是鸡胚中的母源抗体可干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量。其中表现得最明显的是鸡新城疫和传染性法氏囊病毒，如果在种鸡接种过新城疫和传染性法氏囊油佐剂疫苗，那么在其所产的鸡蛋中就有高水平的母源抗体，这两种母源抗体对同种病毒可产生中和作用，使病毒失活。那么用这种胚制造疫苗，肯定就会导致对接种的疫苗种毒产生中和作用，影响到种毒的繁殖，从而影响到疫苗的质量。现在解决这种问题的有效办法是使用无特定病原（SPF）鸡蛋，而发达国家早已普遍使用这种蛋制造疫苗。

    4．在生产检验环境的技术控制方面：我国的28家兽用生物制品厂大都兴建于50~60年代，由于在计划条件下，一切由行政计划部门说了算，厂家过的是安稳的日子，几十年一贯制，直到现在为止，还有部分厂家吃着那时的老本，生产环境己远远落后于时代的要求。近10年来，农业部已相继出台了一系列管理政策和技术措施，对兽用生物药厂提出了按GMP管理的要求，并规定2005年所有生产企业必须达到GMP标准，在这种形势下，大多数厂家对生产接种、收获、冻干前分装的核心部分按GMP的要求进行了局部改造，少数厂已经或正在新建GMP生产车间，生产环境总的来说已有较大改善，特别GMP概念已深入本领域。另外，农业部对大专院校、科研院所新建的生物制品车间作出规定：凡是列入计划筹建的兽用生物制品车间，设计方案以GMP标准制定，组建以GMP标准监控，验收以GMP标准考查，达不到GMP标准的一律不予审批和验收。目前已有8个兽用生物制品车间通过验收。但目前仍存在严重的管理问题，生物药厂如此，科研单位的生物制品车间也是如此，真正的GMP既要靠硬件，更重要的是得靠软件，仅有一个GMP车间是远远不够的。特别是大多数生物制品厂，在目前这种非GMP生产环境下生产，很难保证疫苗产品质量。