电致孔法透皮给药的研究

     摘要　目的：介绍电致孔法透皮给药研究的最新进展。方法：根据近几年的文献，综述电致孔法透皮给药的机制、与离子导入法的比较、影响电致孔法透皮给药的因素及应用举例等。结果：对电致孔法透皮给药的可行性进行了适当的评价。电致孔法是采用瞬时的高电压脉冲在细胞膜和皮肤上产生暂时的、可逆的、亲水性孔道而增加分子渗透，起效快，效率高，且可脉冲方式给药，与离子导入法既有联系又有区别。脉冲电压是决定电致孔法透皮给药的最重要因素。结论：电致孔法透皮给药非常适用于大分子药物的体内传递，但还存在电屏蔽、仪器微型化等很多困难。
            关键词　电致孔法；透皮给药；离子导入法
            　
             
            　电致孔法(electroporation)是采用瞬时的高电压脉冲电场在细胞膜等脂质双分子层形成暂时的、可逆的亲水性孔道而增加细胞及组织膜的渗透性的过程［1］。
            　　电致孔的现象及一般理论描述在70年代末由Chizmadzher首先提出，它主要用于细胞生物学和生物工程方面，利用电致孔法可以将大分子量的化合物如质体(plasmids)、DNA等导入细胞，实现细胞融合和基因转染(gene transfection)等［2～3］。后来，Weaver等研究将电致孔法用于控制分子穿透组织［3］。此后几年间，关于电致孔法透皮给药的研究越来越多，越来越深入。目前报道电致孔法透皮给药的药物有：美多心安(metoprolol)、促黄体生成素释放激素(LHRH)、芬太尼(fentanyl)、钙黄绿素(Calcein)、sulphorhodamine及一些核苷(nucleosides)、核苷酸(nucleotides)等。
            　　电致孔法是迄今尚未论述的崭新的透皮给药新技术，对于采用传统的被动扩散动力和离子导入法无法实现透皮给药的药物，具有巨大的潜力，可望达到理想的促渗效果。电致孔法透皮给药具有以下优点：①电致孔法是采用瞬时高电压脉冲，对皮肤无损伤，形成的孔道是暂时的，可逆的。②电致孔法透皮给药起效快，没有离子导入法透皮给药的滞后效应。③电致孔法与离子导入法并用，可以大大提高离子导入法透皮给药效率。④电致孔法采用脉冲方式给药，有利于实现生物大分子药物的程序化给药。
            1　电致孔法透皮给药的机制
            　　电致孔法增加皮肤渗透性的确切机制现在不甚清楚，但初步研究表明与下述理论有关：①应用瞬时电脉冲改变皮肤角质层脂质分子的定向排列，形成可渗透性的孔道，这种孔道是暂时的，当脉冲电场结束时，孔道关闭，皮肤渗透性可逆地恢复。②电致孔法透皮给药过程中，除了电致孔引起皮肤渗透性增加外，荷电分子也受电场力的作用，在电场力作用下转运，两者何者为主，决定于外加脉冲电场的电学参数和药物的理化性质［1］。
            　　Rols和Teissie提出皮肤的电致孔包括两个步骤：首先，瞬时脉冲电压下产生可渗透性的孔道，这依赖于外加电场的电压；其次，维持或扩大这些孔道和(或)分子在电场力作用下的转运，这依赖于脉冲时间和脉冲数［2］。
            　　电致孔法透皮给药，药物的转运通道主要是这些新形成的水性孔道，孔道可以在角质层细胞间脂质产生，也可能在角化细胞(corneocyte)膜上形成［3］。
            2　电致孔法与离子导入法的比较
            　　电致孔法与离子导入法都是通过在皮肤上外加电场，促进药物透皮吸收，但二者既有联系，又有差别，也可能互为补充，协同作用。①离子导入主要作用于药物，药物透皮的动力主要是加在皮肤上的电压降。而电致孔法则直接作用于皮肤，在脂质双分子层上形成暂时的孔道，引起皮肤渗透性的增加，药物通过这些孔道扩散透皮。②离子导入过程中，在一定条件下(如低密度电流，长时间应用)也存在着相当比例的电致孔现象，成为离子导入的第三种转运机制［4］。同样，电致孔过程中，荷电分子也受电场力作用，产生电泳现象。③离子导入过程中，药物转运的通道主要是通过皮肤上已经存在的通道如皮肤附属器和固有缺损等细胞间脂质通道，电致孔现象只是第3种通道。而电致孔中，药物转运通道主要是通过在角质层细胞间脂质和角化细胞膜产生新的孔道进行转运［3］。④离子导入应用在皮肤上的电压降较低，一般0.1
            V～5 V。而电致孔在皮肤上电压降很大，大于100
            V［3］。⑤在离子导入前，先加一个电脉冲，可以大大缩短离子导入的起效时间，并增加离子导入透皮给药的效率，电致孔与离子导入在促进药物透皮吸收方面互为补充协同作用［5］。
            3　影响电致孔法透皮给药的因素［2，6～7］
            3.1　电压　一般皮肤上电压降小于100 V时，主要是离子导入，当大于100
            V时，电致孔为主。脉冲电压大，皮肤上电压降亦大，电致孔越多，药物透皮量大。析因实验(factoral design)表明，脉冲电压是决定药物电致孔透皮流量的最重要因素［2］。Weaver实验发现，sulforhodamine在低脉冲电压下不产生电致孔，当超过某一阈值时，产生电致孔现象，药物流量随电压呈线性增加；研究美多心安电致孔透皮实验时也发现，随着脉冲电压的增高，药物流量增加［6～7］。
            3.2　脉冲数　脉冲数增加，药物流量增加，但不是成比例增加，且一定脉冲数后，流量不再随着脉冲数的增加而增加。Vanbever［6］应用双脉冲(第一个脉冲300V，后一个脉冲100V)研究脉冲数对美多心安体外渗透流量的影响：脉冲电场较被动扩散能显著增加药物的透皮，脉冲数从1增加到20，药物渗透流量增大，滞后时间缩短，但无法计算平均流量，因为药物累积渗透量不是随着时间线性增加，脉冲结束后的0min～30 min的渗透速度最快，随后逐渐变慢，直至不再变化，表明皮肤渗透性恢复。
            3.3　脉冲时间　脉冲时间是指每个脉冲周期电压下降37%所需的时间。脉冲时间与回路电阻和电致孔仪的电容有关，等于两者的乘积。当电容高时，电压降在低压范围变化，脉冲时间长；当电容低时，电压降在高压范围变化，脉冲时间短。药物累积渗透量随脉冲时间增加而线性增加，但脉冲时间对药物透皮量的影响较电压小得多。如应用5个100V的脉冲，脉冲时间分别为78，226，405，621，711毫秒(ms)，给脉冲后4 h美多心安累积渗透量随脉冲时间而线性增加［6］。
            3.4　波形　脉冲的波形也影响药物的透皮量。在应用相同能量的条件下，考察了方波波形和指数衰减波形对芬太尼透皮量的影响。结果发现，无论是应用100V，还是250 V脉冲电压，脉冲结束后6h，指数衰减波形脉冲电致孔，芬太尼累积渗透量大。表明指数衰减波形脉冲较方波波形脉冲对芬太尼促渗效果好，这可能是由于在皮肤电致孔的第二步：维持或扩大皮肤孔道和(或)分子的电泳迁移阶段，指数衰减波形脉冲效率更高［2］。
            3.5　单脉冲与双脉冲　双脉冲是指连续应用两个脉冲，前一个高电压脉冲产生一系列孔道，并开始电致孔迁移运动；后一个低电压脉冲能够维持这些孔道，所以双脉冲比单脉冲效率更高。但研究芬太尼电致孔透皮转运时发现，应用单脉冲或双脉冲对芬太尼的渗透无显著影响。双脉冲对美多心安的透皮也并不必要，在低电压下长时间应用(100V，620 ms)比高电压下短时间脉冲(300V，3 ms)更有效。
            3.6　脉冲应用程序　有两种应用脉冲程序。其一，高电压短时间大脉冲数［LN-HV，如60×(300V，1.6ms)］；其二，低电压长时间小脉冲数［SN-LV，如5×(100 V，200ms)］。两者能量相同，对芬太尼的渗透曲线无影响。但对美多心安的研究发现，LN-HV比SN-LV组效率低，这可能是由于电致孔过程中，美多心安电泳迁移是主要的，而芬太尼渗透则以经过增加渗透性的皮肤孔道的扩散为主。LN-HV增加皮肤渗透性的作用强，SN-LV增加药物电泳迁移的能力强。
            　　SN-LV脉冲对于临床应用更有价值，可以减少脉冲引起肌肉收缩的刺激。
            3.7　药物的理化参数　Pliquett［1］研究calcein和sulforhodamine的电致孔法通过人皮体外渗透时，发现两者转运机制不同，前者由于荷电多(-4价)，以电场力作用的电泳迁移为主，后者荷电少(-1价)，以经孔道的扩散为主。
            3.8　电致孔法与其它方法的并用　最新报道，超声波能够增强电致孔的促渗效果［7］。超声波能通过空化作用引起皮肤角质层脂质结构排列有序性降低，渗透性增加。另外，超声波也能引起对流转运。超声波法与电致孔法的作用机制不同，两者并用产生协同作用。Weaver选择钙黄绿素和sulphorhodamine作为模型药物，超声波应用条件为：超声能量1.4Wcm-2，频率1 MHz或3 MHz；电致孔条件为：脉冲电压20 V到150 V，脉冲时间1ms，指数衰减波形脉冲。结果表明：超声波本身不影响两种模型药物的透皮流量，但两种方法并用后增加电致孔法的稳态流量，钙黄绿素流量比率为2，sulphorhodamine为3；并用后钙黄绿素达稳时间从单独电致孔的15min缩短到并用后的9min；sulphorhodamine在低于某脉冲电压时流量增加为零，超过该阈值后，其流量随电压线性增加；并用能够降低阈值，从电致孔的(53±3)V降至并用后的(46±3)V，在相同脉冲电压下，并用后药物流量大。超声波的空化作用与超声频率成反比，当超声频率＞2.5MHz时无空化作用，所以，当超声频率为3MHz时，超声波不影响电致孔透皮给药。sulphordamine荷电量较calcein少，超声波引起的对流影响相当大。所以关闭电场后，流量不马上降低，但关闭超声波后，流量迅速降低，而calcein在关闭电场后，流量即迅速降低，表明calcein的转运以电场作用为主，而sulphordamine转运，对流起着相当大作用。
            　　电致孔与离子导入并用能够显著增强药物离子导入的转运效率［5，8～9］。促黄体素释放激素(LHRH)应用低密度电流0.5mAcm-2，30 min即可以提高LHRH被动扩散流量5倍左右；离子导入前先施加一个电脉冲(500 V，5ms)，则提高离子导入流量5倍，且应用脉冲数越多，流量增加越多，并用结束后4 h内，被动扩散流量降低，但仍高于处理前被动扩散流量，4h后，被动扩散流量恢复至处理前水平。而单独离子导入处理组，电流结束后，被动扩散流量则降低至处理前水平，表明电致孔能够显著增加LHRH离子导入流量。流量的增加，不是由于电流增加引起，而是电脉冲引起皮肤渗透性能的改变，电场结束后几小时，皮肤渗透性可逆性恢复。皮肤毒性实验表明，脉冲不产生皮肤损伤，高密度电流能引起皮肤产生红斑。
            　　影响电致孔法透皮给药的因素还有很多，但由于电致孔法透皮给药的研究还处于起步阶段，很多方面还有待于进一步深入探讨，所以仅就上述几个因素进行综述且很不完善，起到抛砖引玉作用。
            4　电致孔法透皮给药的应用举例
            4.1　芬太尼［2］　芬太尼是一种吗啡类物质，用于强烈镇痛和麻醉作用，它是一种碱性亲脂性化合物，相对分子量为336，正辛烷/pH
            7.4水中分配系数为717，pKa为8.9，现采用无菌溶液静注给药，也有芬太尼透皮给药的报道，但起效慢，给药14
            h后才产生持续的镇痛作用。芬太尼离子导入给药，可以减少起效时间，实现药物控制释放。
            　　电致孔法透皮给药的研究表明，与被动扩散比较，电致孔法可以大大提高芬太尼的透皮转运。转运量受脉冲电压、脉冲数和脉冲时间影响，而竞争离子和电极极性对其影响不大。表明电致孔后，芬太尼通过孔道的扩散是主要的，电场力作用很小。指数衰减的脉冲比方波脉冲效率高；另外，体外实验中，皮肤电致孔和离子导入法得到的芬太尼渗透曲线相同，但初步体内实验表明电致孔法较被动扩散和离子导入法显著减少起效时间，所以，采用电致孔法透皮给药是一个很有希望的非注射给药途径，达到迅速镇痛效果。
            4.2　促黄体素释放激素(LHRH)［8］　LHRH相对分子量为1 182，荷一价正电荷。低密度电流(0.2 mAcm-2)离子导入30min，药物浓度为6 μgml-1后关闭电流，流量降低；90 min后再离子导入， 流量不增加，若离子导入前先加一高电压脉冲(500V，5 ms)流量迅速增大药物浓度为20 μgml-1，关闭电流后，药物浓度迅速降低，90min后，再给脉冲和离子导入电流则药物浓度又升高，表明重复应用电致孔可以脉动式地增加LHRH的透皮转运，这种脉动式的释药模式对于蛋白质的临床应用是至关重要的，同时，也说明电致孔为实现蛋白质药物的程序化给药提供了一个新方法。
            　　总之，电致孔法透皮给药还是一个崭新的技术，研究的也很不成熟，还有很多问题或困难亟待解决，如：电致孔法采用瞬时高电压，如何进行电屏蔽，保证使用安全是个关键问题。另外，采用电池作电源，实现电致孔仪的便携式、微型化，这些都给电路设计带来了困难。目前，仅美国麻省理工学院的Weaver教授研究小组有较深入的理论研究，他们提出一些数学模型预测电致孔透皮转运的流量，将理论预测值与实验值进行分析比较，确定药物的转运机制、影响因素、转运通道等［1，3］。最新报道,电致孔法与离子导入法并用体外经皮导入核苷，核苷酸取得成功［9］。虽然电致孔法透皮给药距离临床实用化的要求还有相当长的距离，但它非常适用于生物大分子药物的体内传递，这无疑为大分子药物的程序化给药提供了希望和可能，它的研究和开发必将受到国内外药学界的关注。