对微生物测定法在生物等效性研究中地位的考虑

方法学确证在生物等效性研究中起至关重要的作用。就方法学确证而言，现行的《化学药品制剂人体生物利用度和生物等效性研究指导原则（试行）》已明确其考察的基本内容。它包括特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、微生物学和免疫学分析、方法学质控等。

　　微生物测定法（以下简称本测定法）是抗生素药物浓度测定的一种方法，之如其他测定法，也必需遵循方法学确证的一般原则，并将其恰当地应用在合理的范围之内。根据抗生素原形药物和代谢物的活性情况（如β内酰胺类抗生素与β内酰胺酶组成的复方等不在本文讨论之列，另行讨论），将抗生素分成三类：（一）原形药物具有抗菌活性，代谢物不具有抗菌活性。（二）原形药物不具有抗菌活性，代谢物具有抗菌活性。（三）原形药物及代谢物均具有抗菌活性。本测定法就特异性和标准曲线的建立而言，并不普遍适用于上述三类情况。

　　（一）特异性分析

　　特异性是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有数个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。

　　根据前述分类，如果抗生素原形药物具有抗菌活性，代谢物不具有抗菌活性，此类情况下如采用本测定法测定药物浓度，所测抑菌圈直径为原形药物的直接抗菌作用的结果，不具抗菌活性的代谢物对抑菌圈基本不产生干扰作用，所以本测定法对此类情况具有专属性基础。如果抗生素原形药物不具有抗菌活性，代谢物具有抗菌活性，此类情况下所测抑菌圈是代谢物的抗菌作用的结果，不具抗菌活性的原形药物对抑菌圈基本不产生干扰作用，所以本测定法对此类情况也具有专属性基础。如果原形药物及代谢物均具有抗菌活性，其所测得的抑菌圈是原形药物与代谢物共同作用的结果，其共同作用随时间延长，原形药物与代谢物对抑菌圈直径的贡献也有所消长，所以本测定法对于此类情况而言没有专属性基础。所以，从特异性角度分析，本测定法不适用于原形药物与代谢产物均具有抗菌活性的情况。

　　（二）标准曲线分析

　　标准曲线反映的是所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，不同生物样品应配制标准样品制备各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。

　　根据前述分类，如果抗生素原形药物具有抗菌活性，代谢物不具有抗菌活性，如采用本测定法测定药物浓度，标准曲线建立可采用与待测样品中原形药物相同的标准品。如果抗生素原形药物不具有抗菌活性，代谢物具有抗菌活性，标准曲线建立可采用与待测样品中代谢物相同的标准品。如果原形药物及代谢物均具有抗菌活性，标准曲线则无从建立。如果标准曲线采用原形药物或具有抗菌活性的代谢物中的一种标准品，而所测样本含有原形药物及具有抗菌活性的代谢物，标本实测值与标准曲线响应值有着本质的区别。前者为原形药物与代谢物共同作用的结果，后者是原形药物标准品或代谢物标准品单独作用的结果。所以从标准曲线建立角度考虑，本测定法不适用于原形药物与代谢产物均具有抗菌活性情况。

　　（三）等效性分析

　　生物等效性系指一种药物的不同制剂，在相同实验条件下以相同剂量用于人体，其吸收程度和速度无显著性差异，它通过药代动力学参数（主要为AUC和Cmax）的比较来实现其目的。根据前述分类，如果抗生素原形药物具有抗菌活性，而代谢产物不具有生物活性，其药物动力学参数可反映原形药物的吸收程度和速度，受试制剂与参比制剂具备可比性基础。如果抗生素原形药物不具有抗菌活性，而代谢产物具有抗菌活性，其药代动力学参数可反映具有活性的代谢产物的吸收程度和速度，受试制剂与参比制剂也具备可比性基础。如果原形药物和代谢产物均具有抗菌活性，用本测定法获取的药代动力学参数为两者共同作用的结果，不能反映原形药物与代谢产物在体内的动力学过程。

　　综上，在用于生物等效性研究时，本测定法仅适用于抗生素原形药物具有抗菌活性而代谢物不具有抗菌活性，以及原形药物不具有抗菌活性而代谢物具有抗菌活性两种情况，通常不适用于原形药物及代谢物均具有抗菌活性情况。由于本测定法误差较大，而且本测定法的标准曲线本质上是非线性的，需要采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线等，所以，在目前可供选择的药物测定方法种类繁多的情况下，本测定法由于上述原因而应用日渐减少。基于以上分析，请申报单位在进行等效性研究时对选用本测定法采用审慎的态度。